生石花种子萌发及幼苗生长最优条件的筛选

范丽楠，张宗申，刘平武*

(1.广西大学农学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁 530004;2.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034)



生石花种子萌发及幼苗生长最优条件的筛选

范丽楠1，张宗申2，刘平武1*

(1.广西大学农学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁 530004;2.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034)

[目的]优化生石花种子萌及幼苗生长的条件，以提高其种子萌发率。[方法]采用MS、1/2MS、3/4MS等培养基为生石花生长基质，比较不同培养基中种子萌发率和幼苗生长情况，在此基础上进行光照时间、激素配比和浸泡时间的筛选。[结果]1/2MS培养基最适合生石花种子萌发及幼苗生长。16 h为最优光照时间；不同因素影响由大到小依次为浸泡时间、GA浓度、IAA浓度、NAA浓度及6-BA浓度。其中，GA浓度与浸泡时间对种子萌发有显著影响，且0.1 mg/mL的GA浓度以及4 h的浸泡时间为最优组合。[结论]该研究为生石花组织培养快繁技术研究奠定基础。

生石花；培养基；种子萌发；激素；光照时间

生石花(Lithops)是番杏科生石花属多年生小型肉质植物，未开花前的形态像石头半埋在地下，又名石头花。因其形态独特，色彩斑斓，株型小巧，高度肉质，叶形、叶色、花色都富于变化，而栽培又有一定难度，成为目前很受欢迎的观赏性植物[1]。生石花主要产于南非和纳米比亚的温暖、干旱和阳光充足的地区，生长适宜温度为20～24 ℃[2-4]。

生石花作为多肉植物的一种，其繁殖方式以种子繁殖为主，很少采用分株无性繁殖。生石花的种子细小，直径一般为0.1～0.5 mm。除种子发芽力、休眠期外，空气、水分、温度等外部环境条件是种子萌发的关键因素[5]。添加植物激素如细胞分裂素、吲哚乙酸、赤霉素等对种子萌发也有较好的促进作用，此外有些种子的萌发还受到光照的影响[6-8]。自植物组织培养技术发展以来，植物组织培养技术在作物、花卉、药用植物等脱毒、快繁方面得到了广泛应用[9-10]。笔者优化不同培养基类型、激素成分及光照等生石花种子萌发的条件，以期为后续生石花组织培养快繁技术研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料生石花种子购自某市场。将种子进行分装，50颗一份装入1 mL离心管中，共39份。

1.2试验方法

1.2.1种子表面消毒。将烧杯、枪头、无菌水等灭菌后与生石花种子、培养基等一起置于超净工作台紫外杀菌30 min后，按以下步骤进行种子表面消毒：无菌水冲洗3次→70%乙醇浸泡30 s→无菌水冲洗3次→升汞消毒液浸泡10 min→无菌水冲洗4～5次备用。

1.2.2不同培养基种子的萌发差异。采用MS[11]、1/2 MS、3/4 MS和B5[12]4种培养基，以蛭石为基质作为对照组，进行种子萌发差异研究。分别配制500 mL 4种培养基，所有培养基中均添加25 g/L白砂糖和5 g/L琼脂，pH 5.8。高温高压灭菌20 min，每种培养基倒15个平板，静置1 d后备用[13]。

从分好的种子中取出10管，共500粒种子，2管一组，其中一组100粒播种至基质中。各培养基分别选10个平板，利用移液器吸头吸取消毒处理过的生石花种子，均匀接种至培养基上，每个平板接种10～20粒种子，接种后置于25 ℃培养室。

1.2.3不同光照时间种子的萌发差异。利用1/2 MS培养基进行光照试验，将光照培养室内温度设定为25 ℃，保持24 h光照。各处理用报纸遮盖以控制光照时间，光照时间分别为0、8、16、24 h。

1.2.4不同激素及浓度浸泡处理种子的萌发差异。将IAA、GA、NAA、6-BA[14-16]4种不同激素按0、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL 5种不同浓度水平及浸泡1、2、4、8、10 h不同时间水平进行正交试验(表1)。每种处理浸泡1份生石花种子，以种子萌发率为指标。

1.3数据分析不同培养基因素、不同光照因素处理后1～3 d每天记录种子萌发率，其后每3 d记录一次，共记录至第30天，第30天测量根长、茎的高度以及直径作为判断生长情况的指标。生石花种子萌发率计算公式：

萌发率=( 测定时间内正常发芽的种子数/播种种子总数)× 100%

(1)

发芽势=(日发芽种子数达到最高峰时正常发芽的种子数/供试种子数)× 100%

(2)

运用WPS2016(金山)对以上数据进行整理和做图，SAS 9.1.3(SAS Institute)对数据进行方差分析并对平均数进行比较(新复极差法-Duncan’s法)。

表1　正交试验设计

2　结果与分析

2.1不同培养基对生石花种子萌发及幼苗生长的影响

2.1.1不同培养基对种子萌发率的影响。由图1和表2可知，各处理种子萌发率趋势大致相同，生石花种子在第3天左右开始陆续萌发，到第18天萌发率趋于平稳。由最终萌发率(第30天)可见，使用培养基作为基质生石花的萌发率均高于对照。各培养基萌发率以1/2 MS培养基最高，为88%，其他依次为3/4 MS(83%)、MS(80%)、B5(78%)、对照(68%)。而对于使用相同的MS培养基作为萌发基质，其

浓度越稀，萌发率越高，高浓度MS培养基相对低浓度MS培养基对生石花的萌发存在抑制作用。B5培养基在播种3 d左右萌发率高于其他培养基，但约第12天后萌发率增长减缓并趋于平稳，导致1/2 MS培养基在第5～6天超过B5培养基，3/4 MS培养基在第10～11天超过B5培养基，MS培养基在约第19天超过B5培养基。

此外，利用培养基萌发普遍比对照萌发速度快、生长整齐度较好，1/2 MS培养基的种子萌发率最优，整体高于其他培养基。各培养基在第9天萌发速率最高，以1/2 MS发芽势最高，B5和3/4 MS次之，对照最低。

图1　不同培养基对生石花种子萌发率的影响Fig.1　Effects of culture medium on the germination rate of Lithops seeds

培养基种类Mediumtype萌发率Germinationrate∥%发芽势Germinationenergy∥%根长Rootlength∥mm苗高Seedlingheight∥mm茎直径Stemdiameter∥mmB5785719.19Aa3.703.43MS80397.53Cc2.752.931/2MS886514.51ABb4.083.453/4MS835610.93BCbc2.913.11对照CK683414.13ABb4.003.49

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)。

Note：Different lowercases indicated significant differences(P<0.05); different capital letters indicated extremely significant differences(P<0.01).

2.1.2不同培养基对生石花幼苗生长的影响。培养基类型对生石花生长的影响主要表现为对根长的影响，对苗高及茎直径则无显著影响。方差分析结果表明，不同培养基对生石花根的生长有极显著差异，B5培养基中生石花幼苗的平均根长最长，且与1/2 MS和对照差异显著，与3/4MS和MS培养基差异极显著(表2)。观察发现，对照组、1/2 MS培养基以及B5培养基中幼苗根部的须根较多，表明1/2 MS及B5培养基较适合生石花生根并吸收营养。

综上，1/2MS培养基最利于生石花种子萌发，对其根系发育也有较好的促进作用，B5培养基则有利于生石花根系的发育。

2.2光照时间对生石花种子萌发及幼苗生长的影响

2.2.1光照时间对种子萌发的影响。由表3可知，光照时间对种子萌发的影响较小，不同光照时间的种子萌发率均在74%～80%，当光照时间增加至16 h时种子萌发率最高为80%，而24 h时萌发率最低为74%。

2.2.2光照时间对幼苗生长的影响。由表3可知，光照时间对生石花根的生长无显著影响，不同光照条件下平均根长均在14.00～15.00 mm，根系较发达，须根较多；光照时间对生石花的苗高、茎直径以及幼苗形态等有极显著影响。光照时间越长，其苗高越短，茎直径越大，整株苗的颜色越深。其中，0 h光照苗高最高，茎直径最短，植株细长，顶端叶片颜色为黄色，茎部分呈白色(图2A)；8 h光照较无光照苗高矮2 mm，且差异极显著，茎直径略大但无显著差异，植株细长，顶端叶片呈黄绿色，整株苗颜色呈白绿色；16 h光照无论苗高和茎直径与0、8 h均有极显著差异，个体矮壮，长势整齐，整体呈绿色(图2B)；24 h光照较16 h无论苗高和茎直径均有极显著差异，苗高最矮，茎直径最长，植株矮壮，顶端叶片呈深绿色，茎呈绿色。为了保证其正常发育，控制光照时间为16 h。

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)。

Note：Different lowercases indicated significant differences(P<0.05); different capital letters indicated extremely significant differences(P<0.01).

2.3激素配比及浸泡时间对生石花种子萌发的影响由表4可知，各因素最优水平为0 mg/mL IAA+0.1 mg/mL GA+0.8 mg/mL NAA+0.1或0.2 mg/L 6-BA以及4 h的浸泡时间。方差分析结果表明，除浸泡时间和GA浓度外，其他因素对种子萌发率无显著影响。根据表4以及因素水平选取的原则即主要因素选最优水平，次要因素权衡利弊综合考虑，其最优条件为0 mg/mL IAA+0.1 mg/mL GA+0 mg/mL NAA+0 mg/mL 6-BA以及4 h的浸泡时间，即26号为最优条件，与12号相比无显著差异，均可有效提高种子萌发率至94%。

3　结论与讨论

(1)生石花种子萌发和幼苗生长培养基的选择。该研究结果表明，不同培养基的种子萌发率均优于对照，且不同培养基间种子萌发率也存在差异。通过比较培养基中种子的萌发率、幼苗的根和茎生长情况，确定1/2 MS培养基最适合生石花种子萌发与幼苗生长，这与前人通常采用1/2MS培养基作为其他植物种子萌发培养基的结果一致[17-19]。进一步比较MS、3/4MS和1/2MS培养基诱导生石花种子萌发及幼苗生长的结果发现，MS培养基稀释倍数越大越适合生石花种子萌发和幼苗生长。该试验结果表明，18 d前生石花的种子萌发率和发芽势B5培养基均大于MS培养基，其后MS培养基种子萌发率大于B5培养基，最终MS培养基萌发率高于B5培养基2%，差别较小。但B5培养基中生石花根长、苗高和苗直径均优于MS培养基，根系的发达程度极显著优于MS培养基，利用B5培养基进行生石花种子萌发和幼苗生长总体优于MS培养基。如果将B5培养基进行稀释，有可能获得1/2MS新的种子萌发和生长培养基。以上推测正在设计试验进一步验证。

表4　 正交试验结果

(2)生石花种子萌发和幼苗生长光照时间的选择。作为原产地为南非热带地区的观赏植物，生石花接受的光照时间以及强度更长更剧烈，这也造就了其植株矮小、茎部粗壮、叶片深绿等的形态特点，植株太高或茎部太细均是缺乏光照的表现。通过对比不同光照时间下的种子萌发率及幼苗生长情况，发现无光照会导致生石花幼苗生长过于细长，叶片发黄，生石花仅靠根部吸收培养基内营养物质生存，不利于其生长；24 h光照时间下，由于光合作用一直进行，使其叶片生长过快成圆盘状，茎部过短，幼苗整体太过矮小，同样不利于其生长；而16 h光照时间下，无论植株形态或根生长情况都符合正常观赏要求，且符合自然规律。最终确定16 h为最优光照时间。

(3)激素对生石花种子萌发的影响。研究发现，0.1～0.3 mg/mL GA和IAA 以及0.025 mg/mL 6 -BA对羊草种子的萌发有促进作用[20]，用1.5 mg/mL的GA、0.05 mg/mL的6-BA 及0.1 mg/mL IAA 浸种可有效提高香椿种子发芽率[21]，但对于药用紫苏而言，高浓度的6-BA 和NAA有明显抑制作用，GA则有促进作用[22]。该试验结果表明，浸泡时间和GA浓度是影响生石花种子萌发最大的因素(差异达显著水平)，其次是IAA浓度(有差异但未达显著水平)，而NAA浓度及6-BA浓度对种子萌发率的影响最小。最优组合为0 mg/mL IAA+0.1 mg/mL GA+0 mg/mL NAA+0 mg/mL 6-BA及4 h的浸泡时间。GA对种子萌发有促进作用，与前人研究结果一致[20-22]。而6-BA、IAA以及NAA对生石花种子萌发率无显著影响，与前人的研究结果不一致[20-21]，可能是由于物种不同，种子萌发过程对激素的敏感程度不同。

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Screening of Different Mediums and Hormone Concentrations for Seed Germination and Growth Conditions ofLithops

FAN Li-nan1, ZHANG Zong-shen2, LIU Ping-wu1*

(1. School of Aonomy, Guangxi University,State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Nanning, Guangxi 530004; 2. School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian, Liaoning 116034)

[Objective] To optimize the seed germination condition ofLithops, and to enhance the germination rate of seeds using MS culture medium to replace soil as growth medium ofLithops. [Method] Compared with the seed germination rate, root growth and seedling growth in different culture mediums, we screened the illumination time, hormone proportion and soaking time. [Result] 1/2 MS culture medium is the most suitable culture medium for the germination and growth ofLithopsseeds. Illumination for 16 h was the optimal time. The factors influencing degree from big to small was soaking time, GA concentration, IAA concentration and 6-BA concentration. Among them, GA concentration and soaking time had significant effects on seed germination. And 0.1 mg/mL GA and 4 h soaking time were the optimal combination. [Conclusion] This research provides basis for the rapid propagation technique ofLithopstissue culture.

Lithops; Culture medium; Seed germination; Hormone; Illumination time

范丽楠(1990- )，女，山东黄县人，硕士研究生，研究方向：作物种子技术与良种繁育。*通讯作者，研究员，博士，硕士生导师，从事油菜分子生物学研究。

2016-05-18

S 603.6

A

0517-6611(2016)18-123-04