地塞米松对结核性脑膜炎患者单核细胞TLR4 MyD88表达的影响

周　杰　王　敬　冯　薇

重庆三峡中心医院神经内科　重庆　404000



·论著·

地塞米松对结核性脑膜炎患者单核细胞TLR4 MyD88表达的影响

周杰王敬冯薇

重庆三峡中心医院神经内科重庆404000

目的分析地塞米松治疗结核性脑膜炎患者的临床疗效及对单核细胞TLR4、MyD88表达的影响。方法60例结核性脑膜炎患者分为观察组和对照组，观察组36例给予常规抗结核联合地塞米松治疗，对照组仅给予抗结核治疗，分析临床疗效及2组患者外周血单核细胞TLR4、MyD88的表达。结果联合治疗组总有效率为91.67%，显著优于对照组(χ2=5.17，P<0.05)；地塞米松治疗能够显著降低TLR4、MyD88的表达水平。结论抗结核治疗联合地塞米松能显著提高治疗有效率，TLR4-MyD88通路在地塞米松治疗结核性脑膜炎过程中有重要作用。

地塞米松；结核性脑膜炎；单核细胞；TLR4；MyD88

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是结核分枝杆菌经血行或其他途径传播到蛛网膜下腔，累及脊髓膜和脑膜的一种非化脓性炎性疾病，具有极高的致死率和致残率[1]。近年耐药株的增加及AIDS流行等导致TBM发病率呈上升趋势，严重威胁患者的生命健康，早期诊断并给予积极治疗是良好预后、预防并发症的前提条件。Toll样受体是固有免疫中一种重要的识别受体，其中TLR4分布于抗原提呈细胞，TLR4可以通过下游MyD88依赖途径进行信号传导，促进炎性细胞因子的分泌[2]。地塞米松对免疫应答起双向调节作用，可以诱导静息状态下T细胞表达TLR4，却抑制活化T细胞TLR4的表达[3]。本研究基于TLR4/MyD88信号通路探讨地塞米松减轻结核性脑膜炎患者过度免疫反应的可能机制，为临床提供参考。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2013-07—2015-04我院神经内科住院治疗并经改良抗酸法确诊的60例结核性脑膜炎患者为研究对象，观察组采用常规抗结核联合地塞米松(西南药业，国药准字H50021462，1 mL：5 mg)治疗，对照组采用常规抗结核治疗，2组患者均签署知情同意书，在年龄、病程等方面差异无统计学意义(P>0.05)，有可比性。

1.2治疗方法对照组给予抗结核治疗，包括抗结核化治疗，降低颅内压，脑水肿等，利福平1.45～0.6 g/d，异烟肼0.6 g/d，乙胺丁醇 0.75 g/d，吡嗪酰胺 1.0～1.5 g/d，3个月强化治疗后给予12个月巩固治疗，口服1次/d；根据患者的体质量予以20%甘露醇进行治疗，于1 h内静滴完毕。观察组在对照组治疗的基础上给予地塞米松10 mg/d静滴。

1.3检测指标与方法外周血单核细胞分离：在抗结核治疗前、抗结核治疗1周、抗结核治疗2周3个时间点采集肘静脉血5 mL，加入肝素抗凝管并混匀，采用HISTOPAQUE-1077淋巴细胞分离液(Gibco-BRL公司)分离外周血单核细胞，操作参照试剂说明书。RT-PCR检测外周血单核细胞中TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表达水平：按照Trizol Reagent(上海生工生物公司)试剂盒说明书提取外周血单核细胞总RNA，并应用随机引物和反转录酶试剂盒(Superscript Ⅱ)反转录合成cDNA第一链，然后以RT-PCR检测TLR4 mRNA及MyD 88 mRNA表达水平，采用GAPDH基因作为内参。目的基因相对表达量=2-△△CT。Western Blot检测外周血单核细胞中TLR4及MyD88表达水平：将收集的单核细胞加入200 μL细胞裂解液(50 mM Tris-Hcl pH 8.0，150 mM PMSF，0.1%NP-40，蛋白酶抑制剂)。4 ℃12 000 r/min离心15 min，取上清，采用Bradford法检测蛋白浓度；取上述制备的蛋白样品50 μg上样到15% SDS-PAGE凝胶，电泳完毕后将蛋白电转至NC膜，用5%脱酯奶粉封闭，分别加一抗(美国sigma公司)，37 ℃孵育2 h，经0.1%TBST漂洗后加二抗(1：2 000)室温孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X光胶片定影，扫描后用IPP 6.0进行图像分析。

1.4疗效标准临床疗效判断：显效：体温恢复正常、症状缓解，意识清晰，脑脊液常规及生化指标显著改善；有效：体温正常，症状部分缓解，脑脊液常规及生化指标好转；无效：上述各指标、症状无改善或恶化；死亡。

2　结果

2.12组临床疗效比较观察组显效23例，有效10例，总有效率91.67%，显著优于对照组(χ2=5.17，P<0.05)。见表1。

2.22组外周血单核细胞TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表达比较采用RT-PCR对2组患者外周血单核细胞TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表达水平进行分析，结果显示观察组外周血单核细胞TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05)。见表2。

表1　2组临床疗效比较　(n)

表2　2组外周血单核细胞TLR4 mRNA及MyD88 mRNA表达分析

注：与对照组比，*P<0.05

2.32组外周血单核细胞TLR4及MyD88表达比较采用Western Blot对2组患者外周血单核细胞TLR4及MyD88表达水平进行分析，结果显示观察组患者外周血单核细胞TLR4及MyD88表达水平显著低于对照组(P<0.05)。见表3、图1。

表3　2组外周血单核细胞TLR4及MyD88表达比较

注：与对照组比，*P<0.05

图1　2组TLR4及MyD88表达

3　讨论

结核性脑膜炎是全球范围内公共卫生领域的一个难题，尤其在落后的国家和地区，流行病学研究显示1/3的TBM患者死亡，在合并HIV感染患者中病死率更高[4]。部分患者会留下如脑梗死、脑积水、颅内神经损害等严重的中枢神经系统后遗症。早期诊断和及时对症治疗对结核性脑膜炎患者预后至关重要。目前对于结核性脑膜炎的治疗包括对症支持、抗结核药物治疗及预防并发症等[5]。早期、足量、联合及全程用药是抗结核药物的应用原则，及早应用皮质激素治疗能够降低颅内压，减轻脑水肿，抑制纤维化防止粘连，减轻中毒症状。刘海梅等[6]研究显示，在常规抗结核治疗的基础上给予鞘内给药加脑脊液置换治疗临床治愈率和有效率明显提高，患者脑脊液压力及各项生化指标恢复时间显著提前。尹忠平等[7]在常规抗结核治疗基础上给予地塞米松冲击治疗能够在不增加不良反应的同时显著提高临床疗效，缩短治疗时间。地塞米松是强效的抗炎物质，作为主要的免疫调节剂一直应用至今，能影响炎性级联的多重通路，对免疫应答反应起双向调节作用。由于使用地塞米松有导致结核扩散的风险，因此在严重的结核感染患者中忌用。

当结核分枝杆菌通过呼吸道传播途径进入宿主肺泡巨噬细胞后，细菌开始复制并扩散进入区域淋巴循环系统，在获得性免疫反应启动之前，细菌可通过血液传播散播到身体其他器官，引起TBM等肺外结核的发生。该过程受到机体固有免疫反应性质和程度的影响，Toll样受体为跨膜信号传导受体，通过对病原微生物表面高度保守的结构PAMPs的识别发挥作用[8]，通过激活一系列信号级联反应诱导细胞因子和炎症因子的产生，在结核分枝杆菌感染中发挥重要的作用。体外研究证实，地塞米松能够抑制LPS刺激TLR4的表达[9]，而TLR4的活化减少会调节下游MyD88的表达，抑制炎症反应[10]。因此本研究基于TLR4-MyD88信号途径探讨地塞米松治疗结核性脑膜炎的作用机制，研究显示，与对照组比，常规抗结核治疗联合地塞米松能够显著提高结核性脑膜炎的有效率，且能够抑制患者外周血单核细胞中TLR4及MyD88的表达，提示TLR4/MyD88信号通路可能在结核性脑膜炎的发生发展及地塞米松的作用过程中有重要的作用。

[1]汤海燕，谈鹰，张栗，等.脑脊液与血浆生化指标比值对结核性脑膜炎与化脓性脑膜炎的鉴别意义[J].中国全科医学，2015，18(14)：1 705-1 707；1 710.

[2]赵乃倩，王冬青，荣青峰，等.软脂酸增加血管内皮细胞Toll样受体4表达及活化TLR4炎症信号通路[J].南方医科大学学报，2013，33(12)：1 775-1 777；1 800.

[3]王志，计国义，李扬，等.地塞米松对内毒素休克大鼠脑皮质TLR4、IκBα和IL-18 mRNA表达的影响[J].吉林大学学报：医学版，2007，33(5)：841-844.

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[5]闵丽，熊小平，王荣耀，等.脑脊液置换加鞘内给药治疗结核性脑膜炎的临床疗效评价[J].中国药业，2013，22(15)：35-36.

[6]刘海梅，韩丽，张成辉，等.鞘内给药加脑脊液置换治疗结核性脑膜炎的临床分析[J].中国医药导刊，2015，17(2)：125-126；129.

[7]尹忠平，邓雷梅，罗昌菊，等.结核性脑膜炎患者地塞米松冲击治疗的临床研究[J].中华医院感染学杂志，2014，24(15)：3 736-3 738.

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[10]Ding Y，Yang H，Xiang W，et al.CD200R1 agonist attenuates LPS-induced inflammatory response in human renal proximal tubular epithelial cells by regulating TLR4-MyD88-TAK1-mediated NF-κB and MAPK pathway[J].Biochem Biophys Res Commun，2015，460(2)：287-294.

(收稿2015-09-17)

Effects of dexamethasone on the expressions of TLR4 and MyD88 in peripheral blood monocytes in tuberculous meningitis patients

ZhouJie，WangJing，FengWei

DepartmentofNeurology，theCentralHospitalofThreeGorges，Chongqing404000，China

ObjectiveTo analyze the effects of dexamethasone on the expressions of TLR4 and MyD88 in peripheral blood monocytes in tuberculous meningitis patients.MethodsSixty cases with tuberculous meningitis were divided into observation group and control group，and 36 cases in the observation group were treated with conventional anti-TB therapy in combination with dexamethasone，the control group only received anti-TB treatment.Then clinical efficacy and the expressions of TLR4 as well as MyD88 in peripheral blood monocytes were analyzed.ResultsTotal effective rate in the observation group was 91.67%，and was significantly better than that in the control group (χ2=5.17，P<0.05)；Dexamethasone treatment could significantly reduce the levels of TLR4 and MyD88 expressions.ConclusionsAnti-TB therapy plus dexamethasone can significantly improve clinical efficacy.And dexamethasone via TLR4-MyD88 pathway may play an important role in tuberculous meningitis.

Dexamethasone；Tuberculous meningitis；Monocytes；TLR4；MyD88

重庆市卫生局医学科研项目，编号：2013-2-172

R529.3

A

1673-5110(2016)17-0001-02