大鼠血管组织提取物体外控制间质干细胞转向内皮细胞的分化研究

梁晓鹏，田力

1.辽宁何氏医学院组织工程实验室，辽宁沈阳 110000；2.沈阳医学院临床教研室，辽宁沈阳 110000

大鼠血管组织提取物体外控制间质干细胞转向内皮细胞的分化研究

梁晓鹏1，田力2

1.辽宁何氏医学院组织工程实验室，辽宁沈阳 110000；2.沈阳医学院临床教研室，辽宁沈阳 110000

目的 研究大鼠血管组织提取物于体外诱导骨髓间质干细胞（MSCs）向内皮细胞的分化能力。方法 2015年6—9月间使用淋巴细胞专用分离液对15例大鼠MSCs进行分离，以贴壁法行培养扩容，再采用流式细胞法检测MSCs的表层抗原水平，以基础培养液为实验A组，以含热处理的血管组织细胞提取物的培养液为实验B组，以含大鼠血管组织细胞提取物的培养液为实验C组，以含原代血管内皮组织细胞提取物的培养液作为实验D组，将第4代MSCs分别加入四组进行分化培养，分析对比细胞的表达变化，并检测内皮组织细胞于特异性标志物之变化表达。结果 实验C组的MSCs的细胞形态未见显著改变，但细胞内的基因表达可见明显改变，内皮细胞的特异性基因CD144、CD34、CD31以及eNOS（endothelial nitric oxide synthase）出现高表达。结论 血管组织细胞的提取物中含有能够诱导大鼠MSCs向内皮组织细胞分化的成份，提示成体细胞的内组成份对于相邻干细胞之分化结果具有至关重要的控制作用。

骨髓间充质干细胞；组织细胞提取物；血管内皮细胞；分化

髓间充质干细具有低免疫原、高增殖能力及多向分化性的特点而受到广泛关注，近些年来国外对于自体的MSCs医治心梗与缺血性疾病方面已有深入研究，但国内仍处于初级阶段[1]。MSCs具备多向分化的隐性能力，于适当条件诱导下可分化为同源性胚层间质组织细胞，并可分化为突破胚层的非中胚层间质组织细胞[2]。该研究旨在分析血管组织提取物于体外对于MSCs分化的影响，于2015年6—9月间以15例大鼠作为研究对象进行相关实验研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将制备的第4代MSCs分别加入4种诱导分化培养基中诱导分化，设置为4个实验组，以单纯基础培养液为实验A组，以血管组织的上清液加热至沸点15 min后立即以冰浴冷却加入至培养液中为实验B组，以血管组织的上清液加入培养液中为实验C组，以同条件下培养的原代血管内皮细胞上清液加入培养液中为实验D组（阳性对照组），各组体积数均相等；行基因特异性表达分析。各组均每隔2～3 d更换培养液1次，诱导培养均进行7～14 d；待细胞培养生成单层，细胞增殖至完全覆盖瓶底80%时，以0.125%的胰酶进行消化传代培养。

1.2 材料

选用上海加科出品的SD大鼠、杭州四季青出品的胎牛血清、Hyclone链霉素-青霉素双抗、Amresco蛋白酶抑制剂，Gibco：DMEM培养基含1.0 g/L葡萄糖、淋巴组织细胞分离溶液、混合性胶原酶与胰蛋白酶，Trizol、Invitrogen-Reagent、Promega-Taq DNA polymerase、BBI-DNA marker、Promega-d NTPs、Invitrogen-M-MLV Reversetranscriptase、琼脂糖、琼脂粉、DEPC。

1.3 方法

大鼠MSCs的分离与培养，按SD大鼠体重以50 mg/kg比例给予戊巴比妥钠（国药准字H31021724）腹腔注射麻醉，于无菌条件下剥离出股骨与胫骨，切除两端干骺端充分显露出骨髓腔。以10%的胎牛血清、加入双抗的DMEM 100 U/mL配制为含20%肝素的基础培养液，用基础培养液对骨髓腔进行反复冲洗，制备细胞混悬液，将混悬液滴注于离心管内同体积的淋巴组织细胞分离液的上层，1 500 rpm离心20 min，离心后离心管内可见4层物质，采集中部交界处的乳白色个体核细胞层，以基础培养液定容至6 mL，离心5 min，弃上清液，注入基础培养液配制为个体核细胞的悬液，计数。将个体核细胞按1×105cells/mL的密度种植于培养瓶内，于37℃的5%CO2培养箱之中进行培养，24 h后将未贴壁的细胞悬液吸出再次培养，培养基每隔3 d进行1次换液，2周后当贴壁细胞计数达融合90%程度时以0.125%的胰酶消化，以1∶3进行传代，定期采取处于生长状态下的细胞倒置，使用倒置相差型显微镜观察细胞形态。

血管细胞组织提取物的制备，于无菌环境下剥离取得大鼠的新鲜血管细胞组织，使用PBS将新鲜血管细胞组织反复冲洗3次，彻底清除表层附着物。将新鲜血管细胞组织剪碎，置于0.5%的混合性胶原酶中在37℃条件下消化6 h。离心后去上清，以0.25%胰蛋白酶再次消化。离心后采集沉淀细胞，以1∶100蛋白酶抑制液、含重悬细胞的细胞裂解液，超声裂解细胞，在4℃下，定容14 000 g离心15 min，离心两次。收集血管细胞组织的上清液于无菌条件以0.22 um过滤器进行过滤，静置于4℃的冰箱内保存待用。

1.4 鉴定细胞分化

使用流式细胞分析仪进行细胞表型分析，检测mRNA水平鉴定内皮细胞的特异性基因是否可见表达，据此判断MSCs是否朝向血管的内皮细胞产生分化。引物序列为CD31、CD34、CD144、eNOS以及β-actin。

2 结果

2.1 大鼠MSCs表型与表层抗原结果

于倒置相差型显微镜下所见，大鼠的MSCs经传代培养后呈现为扁平或者多角形，旺盛生长时可呈现为旋涡状。细胞密度升高时胞体形状变为细长，其形态与纤维细胞相似，具体形态见图1。

图1 传代培养后的大鼠MSCs

图2 细胞表层抗原检测

传至P4第4代时，以流式细胞仪对细胞表层标志物的表达进行分析，结果为MSCs表层抗原细胞CD90与CD73为阳性，CD34呈阴性表达。提示P4代的细胞属于较为纯化的MSC见图2。

2.2 诱导后分化细胞的形态学结果

经诱导培养，A、B、C 3组的细胞表层形态未见显著改变，且生长均旺盛，随着传代代数的增加，扁平细胞可见升高，细胞呈明显衰老的状态。

2.3 诱导后分化内皮细胞的特征性基因表达结果

诱导分化后2周，分别提取4组实验细胞的RNA，以RT-PCR对内皮细胞的特征性基因表达进行检测，结果说明加入了血管组织细胞上清液C组与原代培养的内皮细胞D组内，均可见CD144、CD33、CD31及eNOS一氧化氮合酶的表达，未添加血管细胞组织上清液的A组与热处理的B组内则均未见相关基因的表达或者表达量微小，具体情况见图3。

图3 诱导后分化内皮细胞的特征性基因表达结果

3 讨论

MSCs是一组存在于滑膜、骨髓、脂肪等机体多项间质组织中的多功能干细胞，但通常于骨髓中分离获得。近年来，组织工程研究成为一项重点项目，间质干细胞成为当前最常用的一种种子细胞。有研究表明，来源于骨髓间质干细胞MSCs可于局部微环境的干预下重新编程，在体外可定向分化成为脂肪细胞、肌肉细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞以及内皮细胞等[3-5]。刘四红等[6]指出将成骨细胞与内皮细胞进行联合培养，在促进骨形成的同时也能够促进血管的形成。因此体外诱导分化内皮细胞具有重要的临床应用价值。也提示细胞的外基质部分对于干细胞的结局具有关键作用。该次研究于含有内皮细胞提取物的培养诱导溶液中对间质干细胞进行培养，使其于培养14 d后出现内皮细胞的特异标志物表达，印证了MSCs分化的方向不但取决于细胞的外基质环境，并且也可受到环境与成体细胞内的诱导因子干预，分离并鉴别这些相关的诱导因子，对于间质干细胞未来于临床上应用具有不可或缺的意义。

细胞表层分子是细胞分化与定型的一种标志物。MSCs通常不发生分化表达的相关标志有Ⅰ～Ⅲ型胶原、和（或）碱性的磷酸酶等，细胞培养至贴壁附着时，细胞可见 均 一 表 达 的 有 CD44、CD90、CD73、CD124、CD105、CD120a等多种表层蛋白[7-10]。目前对于MSCs的表层特异标志物仍存在 许多不同观点，认识尚未完全明确。本次实验中选择CD73与CD90作为MSCs的表层特征分子行细胞的鉴定。CD144、CD31、CD34及一氧化氮合酶等是血管内皮组织细胞广泛认可的特异标志物[11-14]。梁峰等[15]研究结果表明诱导7 d后可见CD34、CD31、F1K-1以及vWF的阳性表达。与该次研究结果相符。该组研究采用胰酶与胶原酶与彻底清除了细胞的外基质相关成份。而后裂解了内皮细胞组织，充分显露其内容物，使其可与间质干细胞直接结合，成功的将其诱导分化为能够发生血管内皮组织细胞特异标志物表达的细胞，证实了MSCs具有多向分化的潜能，同时也印证了MSCs的诱导条件与分化机制十分复杂，过程中可被诸多因素所左右。在图3中能够看出，热处理后的血管细胞上清液对MSCs进行诱导分化培养后，可见CD31与CD34有部分表达，分析其原因可与血管细胞组织提取物中所含有的非蛋白质型诱导因子或蛋白因子的不完全变性，使MSCs发生部分分化有关。

综上所述，以大鼠血管组织提取物在体外可诱导间质干细胞朝向内皮细胞分化，MSCs可于体外培养扩增，能够作为组织工程法建构血管的一项种子细胞，对于未来应用于临床血管相关疾病或外伤均具有重要意义。

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Study on the Control of the Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Into Endothelial Cells in the Blood Vessel Tissue of Rats

LIANG Xiao-peng1，TIAN Li2
1.Tissue Engineering Laboratory of Ho's Medical College in Liaoning，Shenyang,Liaoning Proivnce,110000 China；2.Department of Clinical Laboratory,Shenyang Medical College，Shenyang,Liaoning Proivnce,110000 China

Objective To study the vascular tissue of rats to extract inducing bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)into endothelial cells differentiation.Methods From June to September 2015 using a separate liquid special for separation of 15 cases of lymphocytes in MSCs rats by adherent culture expansion,then the surface antigen level and flow cytometry was used to detect MSCs,in the basic culture medium as experimental group A,in cultured vascular tissue cell extracts containing heat treatment for the experimental group B in the medium containing vascular tissue,cell extracts of rats as experimental group C,with the medium containing primary vascular endothelial cells extract as experimental group D,the fourth generation of MSCs were added to the four group of differentiation and expression analysis of comparative cell change,and detect the endothelial cells on specific markers the change of expression. Results The cell morphology in experimental group C MSCs no significant changes,but the genes within the cell Expression of visible change obviously,endothelial cell specific gene CD144,CD34,CD31,and eNOS appear high expression.Conclusion Vascular tissue and cell extracts containing can induce rat MSCs to the composition of the endothelial cell differentiation,it was suggested that the somatic components to adjacent stem cell differentiation results have important role in controlling.

Bone marrow mesenchymal stem cells；Mesenchymal stem cells；Cell extracts；Endothelial cell differentiation

R3；R74

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2016.02.03.20

2016-07-12；

2016-08-09

梁晓鹏（1978.10-）,男，辽宁沈阳人，硕士，中级工程师,研究方向：干细胞诱导分化。