UPLC-MS/MS法同时检测人血浆中唑吡坦、右佐匹克隆和扎来普隆的方法研究Δ

魏　欣，安　静，吴　茵，董占军，范理菊，白万军（河北省人民医院药学部，石家庄　050051）

·临床药学与研究·

UPLC-MS/MS法同时检测人血浆中唑吡坦、右佐匹克隆和扎来普隆的方法研究Δ

魏欣＊，安静，吴茵，董占军#，范理菊，白万军（河北省人民医院药学部，石家庄050051）

目的：建立快速、准确、可同时检测人血浆中唑吡坦、右佐匹克隆和扎来普隆的分析方法。方法：血浆样品经液-液萃取后，以卡马西平为内标，采用超高效液相色谱-串联质谱法检测。色谱柱为WatersACQUITY UPLC HSS T3，流动相为0.1%氨水-乙腈（梯度洗脱），流速为0.2 ml/min，柱温为40℃，进样量为5 μl。采用电喷雾离子源，以多反应监测方式进行正离子扫描，用于定量分析的离子对分别为m/z 308.2→263.1（唑吡坦）、m/z 389.3→245.0（右佐匹克隆）、m/z 306.2→236.1（扎来普隆）、m/z 237.3→151.2（内标）。结果：唑吡坦、右佐匹克隆、扎来普隆血药浓度分别在0.02～20.00、0.50～20.00、0.02～20.00 ng/ml范围内线性关系良好（r分别为0.990 1、0.996 8、0.991 7），定量下限分别0.02、0.50、0.02 ng/ml，检测限分别为0.01、0.20、0.01 ng/ml；日内、日间RSD＜15%，提取回收率为88.9%～106.5%，基质效应为94.8%～106.3%。结论：该方法简便、快速、灵敏度高、专属性好，可用于人血浆中唑吡坦、右佐匹克隆和扎来普隆的同时检测。

超高效液相色谱-串联质谱法；唑吡坦；右佐匹克隆；扎来普隆；检测

1　材料

1.1仪器

LC-30AD型超高效液相色谱系统（日本岛津公司）；AB Sciex Triple Quad 5500型三重四级杆串联质谱仪（美国AB公司）；Zentrifuge 1602型高速低温离心机（德国Hettich公司）；KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AB204-S标准型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；XW-80A型旋涡混合器（上海精科实业有限公司）。

1.2药品与试剂

唑吡坦对照品（批号：171258-200601，纯度：99.0%）、右佐匹克隆对照品（批号：100871-200801，纯度：100.0%）、扎来普隆对照品（批号：100670-200401，纯度：98.5%）、卡马西平对照品（内标，批号：100142-201105，纯度：99.0%）均购自中国食品药品检定研究院；二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、甲酸、甲酸铵均为色谱纯，氢氧化钠为分析纯，水为纯净水。空白血浆来源于我院体检中心。

2　方法与结果

2.1色谱与质谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：0.1%氨水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～1.00 min，70%A；＞1.00～6.00 min，70%A→10%A；＞6.00～7.00 min，10%A；＞7.00～7.01 min，10%A→70%A；＞7.01～10.00 min，70%A）；流速：0.2 ml/min；柱温：40℃；进样量：5 μl。

采用电喷雾离子源（ESI），以多反应监测（MRM）模式扫描，正离子方式检测。电喷雾电压（IS）：5 500V；离子源温度（TEM）：650℃；气帘气（CUR）压力：35 psi；碰撞气（CAD）压力：8 kPa；辅助气1（GS1）压力：65 psi；辅助气2（GS2）压力：65 psi；射入电压（EP）：10 V；射出电压（CXP）：14 V；其余质谱参数见表1。

表1　质谱参数Tab 1　Parameters of mass spectrometry

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液精密称取各对照品适量，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得唑吡坦、右佐匹克隆、扎利普隆质量浓度约为1 mg/ml的对照品贮备液，置－20℃冰箱中保存。精密吸取各对照品贮备液适量，置于同一量瓶中，用甲醇配制成质量浓度为1 mg/ml的混合对照品贮备液，并逐级稀释成质量浓度为200、100、50、10、5、2、1、0.5、0.2 ng/ml的系列混合对照品溶液。

2.2.2内标溶液精密称取内标对照品适量，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为1 mg/ml的内标贮备液，置－20℃冰箱中保存。精密吸取内标贮备液适量，置于100 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成质量浓度为10 μg/ml的内标溶液，备用。

2.3血浆样品处理

取血浆0.1 ml，置于1.5 ml塑料离心管中，加入内标溶液10 μl，涡旋混匀15 s，加入0.01 mol/L氢氧化钠溶液10 μl，涡旋混匀15 s，加入萃取溶液[二氯甲烷-正己烷-乙酸乙酯（5∶4∶1，V/V/V）]400 μl，涡旋混匀1 min，以离心半径5 cm、转速14 000 r/min高速离心5 min，取上清液，用氮气吹干，残渣用80%乙腈复溶，取5 μl进样分析。

2.4方法学考察

2.4.1专属性考察通过比较空白血浆与含药血浆样品，考察内源物质是否会对检测造成影响。结果显示，在“2.1”项色谱与质谱条件下，内源性物质无明显干扰，唑吡坦、右佐匹克隆、扎来普隆与内标峰形良好，保留时间分别为5.75、5.25、5.35 min。其典型色谱图见图1。

2.4.2标准曲线制备和定量下限考察取空白血浆及相应质量浓度的混合对照品溶液各适量，分别配制成相当于唑吡坦质量浓度为0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、5.00、10.00、16.00、20.00 ng/ml，右佐匹克隆质量浓度为0.50、1.00、5.00、10.00、16.00、20.00 ng/ml，扎来普隆质量浓度为0.02、0.05、0.10、0.20、 0.50、1.00、5.00、10.00、16.00、20.00 ng/ml的血浆样品，按“2.3”项下方法处理后，进样测定，记录色谱图。以待测物质量浓度（x）为横坐标、待测物与内标峰面积的比值（y）为纵坐标，用加权最小二乘法（加权系数w=1/x2）进行线性回归，得回归方程分别为——唑吡坦：y唑=1.650 0x唑+0.014 1（r=0.990 1，n= 3）；右佐匹克隆：y右=0.020 8x右－0.000 4（r=0.996 8，n=3）；扎来普隆：y扎=0.400 0x扎+0.003 4（r=0.991 7，n=3）。结果表明，唑吡坦、右佐匹克隆、扎来普隆血药浓度分别在0.02～20.00、0.50～20.00、0.02～20.00 ng/ml范围内线性关系良好，r＞0.990；其定量下限分别为0.02、0.50、0.02 ng/ml，检测限分别为0.01、0.20、0.01 ng/ml。

图1　典型色谱图A.空白血浆；B.空白血浆+待测物+内标；1.唑吡坦；2.右佐匹克隆；3.扎来普隆；4.内标Fig 1　Typical chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+analyte+internal standard；1.zolpidem；2.eszopiclone；3.zaleplon；4.internal standard

2.4.3精密度与准确度试验分别配制唑吡坦低、中、高质量浓度（0.05、0.50、16.00 ng/ml，下同）的血浆样品，右佐匹克隆低、中、高质量浓度（0.50、5.00、16.00 ng/ml，下同）的血浆样品，扎来普隆低、中、高质量浓度（0.05、0.50、16.00 ng/ml，下同）的血浆样品各5份，连续测定3 d，根据当日标准曲线计算各待测物的实测质量浓度，考察各质量浓度下的精密度与准确度。结果显示，三者日内、日间RSD＜15%，回收率为88.6%～112.2%，表明方法的精密度、准确度良好。精密度与准确度试验结果见表2。

2.4.4提取回收率和基质效应试验分别配制唑吡坦、右佐匹克隆、扎来普隆低、中、高质量浓度的血浆样品，每质量浓度取5样本分析，按“2.3”项下方法处理后，进样分析，记录相应峰面积（C）。取空白血浆适量，按“2.3”项下方法处理后加入适量相应质量浓度的对照品溶液，使最终质量浓度与前者相对应，每质量浓度取5样本分析，记录相应峰面积（B）。取相应质量浓度的对照品溶液适量，不经处理，直接进样分析，记录相应峰面积（A）。按公式：提取回收率（%）=C/B×100%、基质效应（%）=B/A×100%计算。结果显示，唑吡坦、右佐匹克隆和扎来普隆的提取回收率为88.9%～106.5%，内标的提取回收率为90.3%；基质效应为94.8%～106.3%，内标的基质效应为104.3%，符合生物样品检测要求[4]。提取回收率和基质效应试验结果见表3。

表2　精密度与准确度试验结果（±s）Tab 2　Results of precision and accuracy tests（±s）

表2　精密度与准确度试验结果（±s）Tab 2　Results of precision and accuracy tests（±s）

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表3　提取回收率和基质效应试验结果（n=5）Tab 3　Results of extraction recovery and matrix effect tests （n=5）

2.4.5稳定性试验配制唑吡坦、右佐匹克隆和扎来普隆低、高质量浓度的血浆样品，分别考察在室温下放置24 h和经历3次冻融循环（－20℃～20℃）后的稳定性。结果显示，各样品的RSD＜15%，表明各待测物在上述条件下稳定。稳定性试验结果见表4。

表4　稳定性试验结果（±s， n=3）Tab 4　Results of stability tests（±s， n=3）

表4　稳定性试验结果（±s， n=3）Tab 4　Results of stability tests（±s， n=3）

待测物唑吡坦右佐匹克隆扎来普隆理论质量浓度，ng/ml 0.05 16.00 0.50 16.00 0.05 16.00室温放置24 h实测质量浓度，ng/ml 0.048±0.006 15.756±1.789 0.484±0.037 15.928±1.327 0.048±0.005 15.918±1.121 RSD，% 11.68 11.35 07.69 08.33 10.29 07.04经历3次冻融循环实测质量浓度，ng/ml 0.052±0.049 15.962±1.198 0.503±0.022 15.141±1.255 0.047±0.004 15.380±1.475 RSD，% 5.84 7.51 4.29 8.32 8.93 9.59

3　讨论

3.1检测方法比较

目前，国内外主要采用气相色谱法[5]、液相色谱法[6]、气质联用法[7]、液质联用法[8-9]等对NBZD血药浓度进行检测。这些方法或多或少存在灵敏度低、样品处理过程复杂、分析时间长等问题。有文献报道，采用荧光色谱法（HPLC-FLU法）测定人血浆中唑吡坦的浓度，灵敏度虽有很大提高，但操作过程繁杂，系统误差大，而且进样体积大，色谱柱耐受性差[10-12]。吴海等[13]采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法同时测定了家兔全血中佐匹克隆、唑吡坦和扎来普隆的浓度，但其分析时间长，检测限为1～3 ng/ml。

UPLC-MS/MS法集液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度、强结构定性等特征于一体，具有专属性强、快速、灵敏、准确、可靠等优点，是化学成分定性定量分析的有力工具。本研究采用UPLC-MS/MS法快速、准确地检测人血浆唑吡坦、右佐匹克隆和扎来普隆的浓度，可应用于临床和法医毒物相关物质的检测、鉴定[14]，为急诊科和法医鉴定此类药物中毒提供了技术支持，同时也为治疗药物监测及临床合理用药提供了参考依据。

3.2液-液萃取条件的选择

前期试验比较了不同萃取时间（0.5、1、2、3、4、5 min）对3种待测物提取回收率的影响，结果表明，各萃取时间下提取回收率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。为保证萃取效率，最终将萃取时间确定为1 min。前期试验还比较了0、0.01、0.02、0.05、0.10 mol/L氢氧化钠溶液对萃取的影响，结果表明，当氢氧化钠浓度为0.01 mol/L时，3种待测物均有较高的萃取率，提示低浓度的碱性萃取液有利于该类物质的萃取，故最终将氢氧化钠的浓度确定为0.01 mol/L。此外，试验还考察了不同体积（100、200、400、600 μl）萃取溶剂（二氯甲烷-正己烷-乙酸乙酯）对萃取效率的影响，结果显示，随着萃取溶剂体积的增加，各待测物提取回收率也随之增大，故最终将萃取溶剂的体积确定为400 μl。

综上，本试验建立了同时检测人血浆中唑吡坦、扎来普隆和右佐匹克隆的UPLC-MS/MS法，该方法具有操作简便、灵敏度高、检测快速等特点，可用于人血浆中NBZD的同时检测。

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（编辑：张元媛）

Study on Simultaneous Determination Method of Zolpidem，Dexzopiclone and Zaleplon in Human Plasma by

UPLC-MS/MS
WEI Xin，AN Jing，WU Yin，DONG Zhanjun，FAN Liju，BAI Wanjun（Dept.of Pharmacy，Hebei Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China）

OBJECTIVE：To develop a method for rapid，accurate and simultaneous determination of dexzopiclone，zolpidam and zaleplon in human plasma.METHODS：After the plasma sample was processed by liquid-liquid extraction，UPLC-MS/MS was established to detect plasma sample with carbamazepine as internal standard.The separation was performed on a Waters ACQUITY UPLC HSS T3column with mobile phase composed of 0.1%ammonium solution-acetonitrile（gradient elution）at flow rate of 0.2 ml/min.The column temperature was set at 40℃，and sample size was 5 μl.The detection was performed by multiple reaction monitoring（MRM）via electrospray ionization（ESI）source in positive mode.The mass transition ion-pairs were as follows：m/z 308.2→263.1（zolpidem），m/z 389.3→245.0（dexzopiclone），m/z 306.2→236.1（zaleplon），m/z 237.3→151.2（internal standard）.RESULTS：The linear range of zolpidem，dexzopiclone and zaleplon were 0.02-20.00，0.50-20.00，0.02-20.00 ng/ml，respectively （r=0.990 1，0.996 8，0.991 7）.LLOQ of them were 0.02，0.50，0.02 ng/ml，and detection limit were 0.01，0.20，0.01 ng/ml.RSDs of intra-day and inter-day were all lower than 15%；extraction recovery were 88.9%-106.5%；matrix effect were 94.8%-106.3%.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，sensitive and specific，and it can be used for simultaneous determination of zaleplon，zolpidem and dexzopiclone in human plasma.

UPLC-MS/MS；Zolpidem；Dexzopiclone；Zaleplon；Determination

R917文献标志码A

1001-0408（2016）23-3194-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.23.09

河北省科技计划项目（No.14273002D）

＊副主任药师，硕士。研究方向：医院药学。电话：0311-85988004。E-mail：13933171365@163.com

主任药师，博士。研究方向：临床药学、药理学。电话：0311-85988604。E-mail：13313213656@126.com

2016-01-17

2016-05-13）