一株氯嘧磺隆高效降解菌分离鉴定及降解条件优化

李春艳，曹会鸣，安雪姣，文璐铭，刘婉君，臧海莲，侯　宁（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨　150030）

一株氯嘧磺隆高效降解菌分离鉴定及降解条件优化

李春艳，曹会鸣，安雪姣，文璐铭，刘婉君，臧海莲，侯宁
（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030）

采用富集培养方法从氯嘧磺隆生产单位排污口处污泥中分离得到一株能降解氯嘧磺隆细菌，命名为D310-5。通过对该菌株形态特征观察，生理生化特性和16S rDNA序列分析，将菌株D310-5鉴定为肠杆菌属（Enterobacter sp.）。采用响应面分析方法探究底物浓度、温度、pH和培养时间对菌株D310-5降解氯嘧磺隆影响，优化菌株D310-5对氯嘧磺隆降解条件。结果表明，菌株D310-5最佳降解条件为底物浓度101.57mg·L-1，温度30.25℃，pH 6.63，培养时间5 d。在最佳条件下，菌株D310-5对氯嘧磺隆降解率为87.57%。

氯嘧磺隆；降解菌；肠杆菌属；响应面分析法；降解条件

李春艳,曹会鸣,安雪姣,等.一株氯嘧磺隆高效降解菌分离鉴定及降解条件优化[J].东北农业大学学报,2016,47(4):65-72.

Li Chunyan,Cao Huiming,An Xuejiao,et al.Isolation and identification of a chlorimuron-ethyl-degrading bacterium and optimization of its degradation conditions[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(4):65-72.(in Chinese with English abstract)

网络出版时间2016-4-22 10:00:53[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160422.1000.008.html

氯嘧磺隆作为广谱高效豆田除草剂具有高效、低毒、广谱、高选择性等优点[1]，但长期施用则产生长残效性，在土壤中沉积可致敏感作物大量减产，形成大豆田轮作障碍[2]。残留氯嘧磺隆会降低土壤酶活性，改变土壤微生物群落结构，导致土壤生产力下降[3-4]。残留氯嘧磺隆通过径流、淋溶等方式进入水体对水生生物存在高风险[5]。因此，减少此类除草剂在土壤中残留成为研究热点。

目前，减轻环境中氯嘧磺隆污染主要有化学水解和微生物降解两种途径，微生物修复作用显著[6]。目前，氯嘧磺隆降解菌株多已被分离筛选，Ma等在长期氯嘧磺隆污染土壤中筛选获得一株氯嘧磺隆降解菌假单胞菌属（Pseudomonas sp.）LW-3，菌株LW-3作用7 d后，可降解初始浓度为50mg·L-1氯嘧磺隆，降解率达70%～80%[7]。Zhang等从氯嘧磺隆污染土壤中分离获得一株能降解氯嘧磺隆真菌掷孢酵母菌株（Sporobolomyces sp.），命名为LF1，该菌在30℃培养条件下，培养4 d后，可将初始浓度为5mg·L-1氯嘧磺隆降解，降解率达77%以上[8]。滕春红等从长期施用氯嘧磺隆大豆田土壤中分离筛选获得一株以氯嘧磺隆为唯一碳源生长的酿酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae）F8，该菌株在麦芽汁液体培养基中培养96 h后，对初始浓度10mg·L-1氯嘧磺隆降解率为93.07%[9]。关靓等从氯嘧磺隆驯化土壤中分离获得一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B1，无机盐培养基中以37℃、120 r·min-1条件下培养96 h后，对初始浓度为10mg·L-1氯嘧磺隆降解率为80%[10]。Zou等分离获得一株氯嘧磺隆降解真菌TR-H，鉴定为黑曲霉属（Aspergillus niger），该菌在30℃恒温震荡培养箱中培养7 d后，可将初始浓度为10mg·L-1氯嘧磺隆降解，降解率达96.59%[11]。国内外对氯嘧磺隆降解研究多以降解菌筛选和降解率初步测定为主，而对目标微生物降解氯嘧磺隆降解条件优化以达到更好降解效果研究报道较少。为进一步丰富氯嘧磺隆降解菌菌种资源，优化菌株降解条件，本研究从氯嘧磺隆生产单位排污口处污泥中筛选分离得到一株能高效降解氯嘧磺隆细菌，结合形态学、生理生化特性和16S rDNA序列分析等鉴定，采用响应面分析方法对该菌株降解条件优化，为氯嘧磺隆污染土壤原位生物修复提供基础。

1　材料与方法

1.1样品来源

污泥样品采自江苏某激素研究所污水处理池（生产磺酰脲类除草剂20余年）；氯嘧磺隆原药（96.02%）由江苏省激素研究所有限公司提供。

1.2培养基

无机盐基础培养液（MSM）：K2HPO40.1 g，CaSO40.04 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，FeSO4· 7H2O 0.001 g，（NH4）2SO40.1 g，加蒸馏水至1 L。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，加蒸馏水至1 L，pH调至7.0～ 7.2。

LB培养基：酵母膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，加蒸馏水至1 L。

以上培养基均在121℃灭菌20min，在配制固体培养基时按2%添加琼脂粉。

1.3氯嘧磺隆降解菌分离

采用富集培养方法，以氯嘧磺隆为唯一碳源，富集培养污泥样品。具体步骤如下：取污泥样品10 g放入装有90mL无菌生理盐水和玻璃珠三角瓶中，振荡约20 s，使样品与水充分混合，形成均匀悬浊液。以10%接种量转接于装有40mL氯嘧磺隆基础培养液250mL三角瓶中，氯嘧磺隆浓度为100mg·L-1，置于30℃，165 r·min-1恒温摇床上培养，以后每隔1周按10%接种量接入新鲜氯嘧磺隆无机盐基础培养液中，以一定浓度梯度提高用量，至培养液中氯嘧磺隆浓度达到1 000mg·L-1，如此驯化约2个月。采用平板划线法，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上对经富集培养后菌液纯化培养。挑取生长较好菌落，于氯嘧磺隆终浓度为500mg·L-1基础无机盐平板上进一步分离纯化3～4次，将得到纯化降解菌株分别回接于含100mg· L-1氯嘧磺隆无机盐基础培养液中测量其生长量（OD600）及降解率，将生长及降解均较好菌株接种于含氯嘧磺隆固体无机盐基础培养基及LB培养基上，保存于4℃冰箱。

1.4氯嘧磺隆降解菌鉴定

将氯嘧磺隆降解菌采用平板划线法接种于无机盐基础固体培养基，30℃恒温培养5 d后观察菌落形态，参照《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化鉴定[12]。采用分子生物学16S rDNA序列分析方法[13]对菌株种属鉴定，引物为通用引物，上游引物BSF8/20（27f）:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；下游引物BSR1510/1492（1492R）:TACGGYTACC TTGT TACGACTT，由大连宝生物有限公司合成，扩增反应体系为：10×buffer（Mg2+）5 μL，dNTPs（2mmol·L-1）4 μL，引物（20 pmol·μL-1）各1 μL，菌体DNA（约50 ng·μL-1）1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.5 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反应条件：95℃5min，94℃30 s，56℃30 s，72℃90 s，30个循环，72℃10min。测序结果用BLAST软件在GenBank中比较同源性，采用软件DNAMAN 8.0构建系统发育树。

1.5氯嘧磺隆降解菌降解率测定

氯嘧磺隆浓度采用高效液相色谱Waters 600检测。色谱柱为symmetry-C18反相柱（250mm× 4.6mm，i.d.5 μm），紫外检测器为Watres 2487，流动相为甲醇：水（pH 3.0）=70 ϑ 30（V/V），冰乙酸调节pH，流量1.0mL·min-1，波长254 nm，进样量20 μL，柱温25℃。氯嘧磺隆采用外标法定量分析[14]。采用Empower Software（Waters,MA,USA）记录和计算氯嘧磺隆峰面积，得出菌株D310-5降解氯嘧磺隆降解率。降解率计算公式：

式中，A0-未接菌对照培养液中氯嘧磺隆平均峰面积；A-接菌处理培养液中氯嘧磺隆平均峰面积。

1.6氯嘧磺隆降解菌降解特性

1.6.1单因素试验

1.6.1.1培养时间对氯嘧磺隆降解菌降解率影响

以3%接种量将菌悬液接种到100mL无机盐基础培养液中，培养时间分别为2、3、4、5、6 d，温度为30℃，pH 6.5，底物浓度为100mg·L-1条件下，检测D310-5对氯嘧磺隆降解性能及生长量（OD600）。

1.6.1.2温度对氯嘧磺隆降解菌降解率影响

以3%接种量将菌悬液接种到100mL无机盐基础培养液中，分别在24、26、28、30和32℃，pH 6.5，底物浓度为100mg·L-1条件下，培养5d后，检测D310-5对氯嘧磺隆降解性能及生长量（OD600）。

1.6.1.3底物浓度对氯嘧磺隆降解菌降解率影响

分别以50、100、150、200、250mg·L-1作为无机盐基础培养液中底物浓度，置于30℃，pH 6.5，接种量为3%条件下，培养5 d后，检测D310-5对氯嘧磺隆降解性能及生长量（OD600）。

1.6.1.4pH对氯嘧磺隆降解菌降解率影响

将无机盐基础培养液初始pH分别调至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在30℃，底物浓度为100mg·L-1，接种量为3%条件下，待培养5 d后，检测D310-5对氯嘧磺隆降解性能及生长量（OD600）。

1.6.1.5接种量对氯嘧磺隆降解菌降解率影响

将菌悬液分别以1%、2%、3%、4%、5%接种量接种到100mL无机盐基础培养液中，置于30℃，底物浓度为100mg·L-1，pH 6.5条件下，待培养5 d后，检测D310-5对氯嘧磺隆降解性能及生长量（OD600）。

1.6.2响应面试验设计

根据单因素试验结果，利用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken design（BBD）模型进行4因素3水平试验设计，以培养时间（A）、温度（B）、底物浓度（C）、pH（D）为自变量，以降解率为唯一响应值，其中试验设计因素水平见表1。二次回归方程用以拟合自变量和响应值之间函数关系[15]，公式如下：

式中，Y-预期响应值；A-常数；Aj-单因素直线系数；Ajj-单因素平方系数；Aij-两个因素交互系数。

表1　菌株D310-5响应面试验因素及水平Table 1　Factors and levels of response surface experiments of strain D310-5

2　结果与分析

2.1降解菌株分离纯化

经分离和纯化获得一株氯嘧磺隆降解细菌，降解率为80%以上。命名为D310-5。菌株D310-5菌落培养特征、革兰氏染色和扫描电镜照片如图1所示，生理生化指标见表2。

2.2基于16S rDNA基因序列系统发育分析

菌株D310-5序列已在GenBank中注册，登录号为KU204704。结果显示，菌株D310-516S rDNA序列与Enterobacter sp.具有较高序列同源性，系统发育关系见图2。

图1　菌株D310-5菌落及菌体形态Fig.1　Morphological characteristics of strain D310-5

表2　菌株D310-5生理生化特征Table 2　Physiological and biochemical characteristics of strain D310-5

图2　降解菌D310-5系统发育树Fig.2　Phylogenetic tree of strain D310-5

由图2可知，菌株D310-5与Enterobacter sp.6-63（KF805388）及 Enterobacter soli strain PR（KP9 66503）相似性均大于95%。因此可将其归为同一属。系统发育树分析可知，菌株D310-5属于En⁃terobacter sp.。

2.3单因素试验

不同因素对菌株D310-5生长量及氯嘧磺隆降解率影响见图3。

由图3a可知，菌株D310-5生长量及氯嘧磺隆降解率随培养时间延长呈先升后平趋势，培养时间为5 d时，菌株D310-5对氯嘧磺隆降解率达82%。

由图3b可知，当温度为30℃时，菌株D310-5生长量和氯嘧磺隆降解率均达到最高点，氯嘧磺隆降解率最大值为81.6%。

由图3c可知，菌株D310-5生长量随底物浓度增加而升高，培养液初始底物浓度为50～250mg·L-1时，菌株D310-5均可生长并具有降解效能，但其降解率随初始培养液中底物浓度呈先升后降趋势，当氯嘧磺隆浓度达100mg·L-1时，菌株D310-5对氯嘧磺隆降解率最高，可达79%。但随底物浓度增加，降解率逐渐下降。

由图3d可知，菌株D310-5生长量和氯嘧磺隆降解率随pH呈先升后降趋势，当pH 6.5～7.0时，菌株D310-5生长量最佳且氯嘧磺隆降解率达最大值，说明菌株D310-5适合在中性偏酸性环境下生长。

由图3e可知，当接种量3%～5%时，菌体生长量及氯嘧磺隆降解率趋于平稳状态，本试验采用3%作为最适接种量。为获得更高降解率，本研究利用响应面分析方法优化菌株D310-5氯嘧磺隆降解条件。

图3　各因素对菌株D310-5生长量及氯嘧磺隆降解率影响Fig.3　Effects of different factors on growth and chlorimuron-ethyl degradation rate of strain D310-5

2.4响应面优化结果

菌株D310-5响应面试验设计结果见表3。利用Design-Expert 8.0.6软件，对BBD模型试验数据进行多项回归分析得到二次拟合模型为：

回归方程中，Y为菌株D310-5氯嘧磺隆降解率；A、B、C、D分别为培养时间、温度、底物浓度和pH。

表3　菌株D310-5响应面试验设计与结果Table 3　Experimental design and results of RSM of strain D310-5

利用Design-Expert 8.0.6软件分析得出菌株D310-5氯嘧磺隆降解率响应分析试验回归分析结果见表4。

由菌株D310-5回归分析结果可知，菌株D310-5降解率模型P<0.0001、F=185.06、失拟P= 0.1235、R2=0.9946，表明该模型与实际情况拟合良好[16-17]。A、B、C、D、AC、AD、BC、BD、CD、 A2、B2、C2和D2P<0.05，说明这些独立变量和交互组合对菌株D310-5降解率影响显著。在独立变量中，A、B、C和D均P<0.0001，但C的F值最大，即P值最小，说明在独立变量中C对菌株D310-5降解率发挥最显著作用。由上述结果可知，氯嘧磺隆降解率响应面分析各变量对降解率影响依次为：底物浓度>pH>培养时间>温度。

表4　菌株D310-5响应分析试验回归分析结果Table 4　Results of the regression analysis of RSA of strain D310-5

不同交互组合对菌株D310-5氯嘧磺隆降解率影响见图4。

由图4a可知，当pH和培养时间固定在零水平（6.5,5 d）时，菌株D310-5降解率较大值在温度30.28～31.03℃和底物浓度101.42～103.51mg·L-1范围内获得。

温度-pH交互组合对菌株降解率影响情况见图4b。当培养时间和底物浓度维持在零水平（5 d，100mg·L-1）时，菌株D310-5氯嘧磺隆降解率较大值在温度31.13～32.05℃和pH 6.55～6.73获得。

图4c为pH-底物浓度交互组合对菌株氯嘧磺隆降解率影响情况。与图4a和4b可知，pH-底物浓度交互组合曲面图最陡峭，说明pH-底物浓度交互组合对菌株氯嘧磺隆降解率起显著作用。

图4　不同因素对菌株D310-5氯嘧磺隆降解率产生交互影响响应曲面Fig.4　Response surface plot of themutual effect on chlorimuron-ethyl degradation rate of strain D310-5

由上述分析结果可知，当各因素固定在零水平时，较大降解率集中在曲面中心区域，在此区域内均存在降解率极值点。经Design-Expert 8.0.6软件分析可得菌株D310-5对氯嘧磺隆降解率最优条件为培养时间5 d，温度30.25℃，底物浓度101.57mg·L-1，pH 6.63。

为验证菌株D310-5氯嘧磺隆降解率响应模型预测降解率准确性和可靠性，在最佳条件下进行3组平行验证试验，结果为87.57%，接近模型预测值88.04%，表明该模型预测准确。

3　讨论与结论

研究者已筛选出多株具有氯嘧磺隆降解能力菌株，但菌株对氯嘧磺隆降解底物浓度较低（5～50mg·L-1），降解所需时间一般为4～7 d，降解效果不理想（70%～80%）[18]。因此，获得高效氯嘧磺隆降解能力菌株对提高氯嘧磺隆降解效率具有重要意义。本研究筛选出以氯嘧磺隆为唯一碳源生长的肠杆菌属（Enterobacter sp.）D310-5，其对氯嘧磺隆降解报道本文尚属首次。该菌株在培养5 d后，对初始浓度100mg·L-1氯嘧磺隆降解率可达80%以上。目前对于肠杆菌属研究仅局限于污水处理[19]、抗病性等[20]。本研究筛选获得氯嘧磺隆降解菌株，可丰富氯嘧磺隆降解菌菌种资源，为实际应用提供理论基础。

本研究在单因素试验中选取温度、底物浓度、培养时间、接种量及pH五个因素，结果表明，菌株D310-5在pH 6.5、培养温度30℃、底物浓度100mg·L-1、接种量3%条件下培养5 d，最高降解率可达82%。为达到更高降解率，利用响应面分析方法对菌株D310-5氯嘧磺隆降解条件优化结果为培养时间5 d，温度30.25℃，底物浓度101.57mg·L-1，pH 6.63，最高降解率达87.57%，比优化前提高6.36%。

菌株D310-5在实验室条件下对氯嘧磺隆有较高降解能力，但其对田间氯嘧磺隆污染土壤实际修复能力尚需深入研究。后续研究中将探讨菌株D310-5对氯嘧磺隆降解机制及与其他氯嘧磺隆降解菌复配制备降解菌剂用于土壤修复可行性，为氯嘧磺隆污染土壤原位生物修复提供研究基础。

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Isolation and identification of a chlorimuron-ethyl-degrading bacterium and optimization of its degradation conditions

LI Chunyan,CAO Huiming,AN Xue-jiao,WEN Luming,LIU Wanjun,ZANG Hailian,HOU Ning(School of Resources and Environmental Sciences,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

A chlorimuron-ethyl-degrading strain D310-5 was isolated from the sludge samples which derived from chlorimuron-ethyl production factory by themethod of enrichment culture.Based onmorphology,physiological and biochemical characteristics,16S rDNA sequence analysis,strain D310-5 was identified asEnterobactersp.The effects of substrate concentration,temperature,pH and culture time on the chlorimuron-ethyl degradation by strain D310-5 were optimized using a response surfacemethodology(RSM).The results showed that the optimal chlorimuron-ethyl degradation conditions were substrate concentration 101.57mg·L-1,temperature 30.25℃,pH 6.63,culture time 5 d.Under the optimal degrading conditions,the chlorimuron-ethyl degradation efficiency of strain D310-5 was 87.57%.

chlorimuron-ethyl;degradation bacterium;Enterobactersp.;response surfacemethodology;degradation conditions

X172

A

1005-9369（2016）04-0065-08

2015-10-20

国家自然科学基金项目（41471263）

李春艳（1970-），女，教授，博士，研究方向为环境微生物学。E-mail:chunyanli@neau.edu.cn