黄芪注射液对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响研究

殷　涛，刘明明

（赤峰学院附属医院，内蒙古　赤峰　024000）

黄芪注射液对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响研究

殷涛，刘明明

（赤峰学院附属医院，内蒙古赤峰024000）

目的：探讨黄芪注射液对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用，进一步讨论其对细胞凋亡的作用机制.方法：72只健康雄性SD大鼠，随机分为假手术组、缺血再灌注组、缺血预处理组和黄芪注射液预处理组，每组按再灌注（1h，6h，24h）三个时间点分3个亚组.建立动物模型；测定组织中Bcl-2、Bax蛋白表达情况及肝组织凋亡指数（AI）；通过透射电镜观察大鼠肝细胞的形态变化.结果：与Sham组相比，IR、IP、A组肝组织中Bcl-2、Bax蛋白表达以及AI均增加（P＜0.05）；与IR组比，IP、A组肝组织Bax蛋白的表达及AI减少，而Bcl-2蛋白表达增加（P＜0.05）；与IP组比，A组肝组织Bax蛋白的表达及AI减少，而Bcl-2蛋白的表达增加（P＜0.05）.通过透射电镜下对肝细胞学观察，可见Sham组肝细胞形态基本正常，IR组损伤最重，IP 及A组肝细胞损伤程度较IR组轻，A组更轻.结论：IP及黄芪注射液都可通过抑制Bax蛋白的表达，上调Bcl-2蛋白的表达，来减轻肝细胞凋亡，相比之下后者效果要更好.

缺血再灌注损伤；肝脏；黄芪注射液；凋亡

肝缺血再灌注损伤（Hepaticischemiareperfusioninjury，HIRI）常见于很多的手术过程中，如肝部分切除术、肝移植等，它直接影响到疾病的预后,在此过程中各种机制相互作用对肝细胞造成损害,进而导致肝功能损害,进一步造成肝脏衰竭.新近的研究表明，细胞凋亡可能在HIRI中起着十分重要的作用[1].细胞凋亡是由多个基因调控下的程序性细胞死亡,而Bax和Bcl-2基因是一组能对细胞凋亡能产生抑制和促进作用的基因.

黄芪注射液能明显改善大鼠肾脏,小肠等器官的缺血再灌注损伤,可能是通过预防生物膜的脂质过氧化,减轻钙超载，抑制凋亡等机理起到保护作用[2-3],但其能否通过抑制肝细胞凋亡来减轻肝脏缺血再灌注后的肝细胞损伤尚有待于进一步研究.本实验通过建立大鼠HIRI模型，在缺血前通过大鼠尾静脉静脉注射黄芪注射液，观察大鼠肝缺血再灌注后肝组织中Bcl-2和Bax蛋白的变化及细胞凋亡率及通过对肝细胞形态学的观察来探讨黄芪注射液对HIRI时细胞凋亡的影响及作用机理.

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康雄性SD大鼠72只,由赤峰学院实验动物中心提供，体重220g～240g.

1.1.2主要试剂黄芪注射液(2ml:100mg)为大理药业股份有限公司生产,产品批号:Z53021585.免疫组化试剂盒Bcl-2，Bax购自上海麦约尔生物科技有限公司.原位细胞凋亡检测试剂盒购自德国罗氏公司.

1.2方法

1.2.1建立实验动物模型各组大鼠在实验室常规饲养.按照规定要求术前禁食水.术前麻醉采用3%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射方式.备皮，常规消毒皮肤.参照Pringle法[4]，建立HIRI模型，取腹正中切口，分离并显露肝门部，剪开左中肝叶各韧带，游离左、中肝叶的胆管及门静脉、肝动脉分支，用无损伤血管夹夹闭供应肝左外叶、肝中叶之门静脉及肝动脉分支，制成70%肝缺血模型（阻断后可见被阻断区肝叶颜色由鲜红色变为暗红色表明肝脏缺血成功），40分钟后移走动脉夹恢复肝脏供血血流.

1.2.2动物分组及处理72只大鼠随机被分为S组、R组、IP组和A组，按再灌注1h、6h、24h三个时间点分为3个亚组.IR组：缺血前5min分别自大鼠尾静脉缓慢注射0.9% NaCl2ml；Sham组：同IR组，但只是暴露肝中叶和左叶的肝蒂，不阻断血流；IP组：在实验前先阻断肝门使其缺血5min，然后开放5min，重复3次；A组：按4g/kg用0.9%NaCl稀释到2.0ml，再灌注前5min自尾静脉注入.

1.2.3标本取材及收集上述各组分别在再灌注1h、3h、24h对6只大鼠取左肝固定部位的组织，大小适中，迅速保存于-80℃冰箱中；每组上述3个时间点各取1只大鼠的左肝固定部分组织，一块快速置于10%中性甲醛中固定；另一块置于3%戊二醛中固定.

1.2.4实验指标检测

1.2.4.1免疫组化染色及结果判定及凋亡检测Bcl-2，Bax免疫组化试剂盒按SP法染色步骤进行.Bcl-2，Bax的阳性表达的判定依据是细胞浆内呈现棕黄色染色.

凋亡细胞检测：按照试剂盒说明书严格进行操作，应用赤峰学院附属医院病理科图像分析系统进行图像处理分析，计算凋亡指数（AI）.

1.2.4.2电镜检查取出固定的肝组织块，按照脱水，浸透，包埋，切超薄，染色，电镜观察，拍片等步骤进行.

1.3统计分析

表1　IR后不同时间点Bcl-2蛋白表达情况（%）

（1）与S组相比，P＜0．05；（2）与IR组相比，P＜0．05；（3）与IP组相比，P＜0．05

表2　IR后不同时间点Bax蛋白表达情况（%）

（1）与S组相比，P＜0．05；（2）与IR组相比，P＜0．01；（3）与IP组相比，P＜0．05

表3　再灌注后不同时间点组肝细胞AI变化

（1）与S组相比，P＜0．01；（2）与IR组相比，P＜0．05；（3）与IP组相比，P＜0．05

四组缺血再灌注6h肝细胞凋亡图片，见图1-4.

2.2观察透镜下肝细胞超微结构变化

缺血再灌注6h后，观察肝细胞超微结构变化，见图5～图8.

利用SPSS16.0统计软件包对实验数据进行处理分析，结果以均数±标准差（±s）表示，p<0.05认为有显著性差异.

2　结果

2.1各组Bax，Bcl-2表达及AI变化

与Sham组相比，IR、IP、A组肝组织Bax、Bcl-2蛋白表达、AI均增加（P<0.05）；与IR组比，IP与A组肝组织Bax蛋白表达及AI减少，而Bcl-2蛋白的表达增加（P<0.05）；与IP组比，A组肝组织Bax蛋白表达及AI减少，而Bcl-2蛋白表达增加（P<0.05）.（见表1-3）

图1　S组HIRI6h凋亡肝细胞数（400）

图2　IR组HIRI6h凋亡肝细胞数（400）

图3　IR组HIRI6h凋亡肝细胞数（400）

Sham组肝细胞内线粒体排列规则，细胞核核膜的双重结构清楚，内质网形态正常，无扩张，且排列规整；IR组线粒体明显肿胀扩张，嵴断裂，部分细胞核核膜消失，部分内质网扩张，其上的核蛋白体脱落；IP组部分线粒体轻微肿胀，无明显扩张或空泡变性，核膜结构较清晰，内质网无明显扩张，排列较规则；A组仅有少量线粒体略微肿胀，内质网稍有扩张，核膜结构很清楚，且排列很规则.

图4　A组HIRI6h凋亡肝细胞数（400）

图5　Sham组肝细胞超微结构（10000）

图6　IR组肝细胞超微结构（10000）

图7　IR组肝细胞超微结构（10000）

图8　A组肝细胞超微结构（10000）

3　讨论

肝缺血再灌注损伤（HIRI）既是一个全身炎症反应的过程，也是一个细胞凋亡的过程[5].在缺血再灌注时由于钙超载、氧自由基、炎症因子等因素共同存在时，肝细胞的线粒体膜通透性发生变化，使得能量合成受到很大影响，进而发生细胞凋亡.Bcl-2作为Bcl-2家族蛋白中重要的抗凋亡基因，在IR中起着至关重要的作用[6]，而Bax作为Bcl-2的同源体，其作用是抑制Bcl-2作用，促进细胞凋亡，两者的表达水平的平衡决定了凋亡信号刺激后细胞的存活或凋亡[7].本实验通过建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，检测肝组织中Bax及Bcl-2蛋白表达及AI来反映肝细胞凋亡程度.

Bcl-2是一种原癌基因，其表达产物定位于线粒体、内质网及核膜上.Bcl-2作为重要的抑制凋亡基因，可通过其表达产物bcl-2蛋白调节线粒体膜上通透性转换孔，从而调节线粒体膜通透性[8].此外，Bcl-2还可以利用抑制钙离子释放，来阻止促凋亡基因信号传递等发挥抗细胞凋亡的作用.Bax基因作为Bcl-2的同源基因，含有和Bcl-2基因一致的同源区域，其表达产物定位与Bcl-2相同，但其作用与Bcl-2蛋白结合形成结合体，两者的比例关系则可以决定细胞的凋亡状态[9].当bax表达高于bcl-2时，形成bax-bax同源二聚体，使细胞凋亡增加；当bcl-2表达高于bax时，bcl-2-bcl-2形成同源二聚体，凋亡受抑制；而当bcl-2与bax表达水平相当时，bcl-2与bax形成异源二聚体，则细胞凋亡终止.从本实验的bax和bcl-2蛋白以及肝细胞凋亡率结果看，与IR组比较，IP、A组肝组织Bax蛋白表达及凋亡指数AI减少、Bcl-2蛋白表达增加（P<0.05）；与IP组比较，A组肝组织Bax蛋白表达及凋亡指数AI减少、Bcl-2蛋白表达增加（P<0.05）.研究表明，在肝缺血再灌注早期，IP通过诱导bcl-2蛋白表达增加，进而改变bax及bcl-2蛋白的比例，形成更多的bcl-2-bcl-2同源二聚体，来抑制肝细胞凋亡.由此推断，本研究中黄芪注射液很可能通过上述途径来抑制肝细胞的凋亡，且效果要比IP组要好.另外，通过对缺血再灌注后肝细胞的微观结构观察，也证实在IR6h后肝细胞的形态结构有很大程度的改变，而A及IP组较IR组损伤较轻，而A组更轻.这也从表明在IR早期，IP及黄芪都对肝细胞有很大的保护作用，这种微观变化可能是通过抑制肝细胞凋亡所起的作用.黄芪所表现的效果显得要更好.

笔者认为，黄芪注射液及IP在肝脏缺血早期都可通过抑制肝细胞凋亡对肝细胞起到很好的保护作用.与IP组比较，其效果要更好.因为肝缺血再灌注损伤是多种因素共同作用的结果，加之诱导肝细胞凋亡的因素也很多，但具体机制可以作为我们的后续研究重点.

〔1〕GujralJS，BucciTJ，FarhoodA，et.Mechanismofcelldeath duringwarmhepaticischemia-reperfusioninrats：apoptosisornecrosis［J］.Hepatology，2001，33：397-405.

〔2〕邵亚芳，徐群，沈艳艳，等.黄芪注射液对肝缺血再灌注损伤所致心功能障碍的保护作用及机制［J］.中国现代普通外科进展，2011，14（1）：20-22.

〔3〕柳家贤，陈金和.黄芪注射液对肠缺血再灌注大鼠肠粘膜细胞凋亡的影响［J］.中国药理与临床，2009，25（2）：50-51.

〔4〕PringleJH.NotesonthearrestofhepatiehemorrhAe duetotrauma［J］.AnnSurg，1908，48（4）：541-549.

〔5〕SelznerM，RudigerHA，SelznerN，etal.Transgenicmice overexpressinghumanBcl-2areresistanttohepaticischemiaandreperfusion［J］.JHepatol，2002，36（2）：218-225.

〔6〕孙凯，刘志苏，孙权.大鼠肝脏缺血再灌注时肝细胞凋亡与Bcl-2蛋白表达的关系［J］.肝脏，2003，8（3）：12-15.

〔7〕OltvalZ，MillimanC，KorsmeyerS.Bcl-2heterodimerizes invivowithaconservedhomolog，bax，thataccelerates programmedcelldeath［J］.Cell，1993，74（4）：609-619.

〔8〕MarchettiP，CastedoM，SusinSA，etal.Mitochondrialpermeabilitytransitionisacentralcoordinatingeventof apoptosis［J］.JExpMed，1996，184：1155-1160.

〔9〕夏先明，苏松，冯春红，等.缺血预处理对肝缺血再灌注时细胞凋亡及调控基因表达的影响［J］.中国现代医学杂志，2007，17（6）：665-668.

R575

A

1673-260X（2016）08-0060-03

2016-06-14

刘明明（1984-），男，赤峰学院附属医院普外二科住院医师，学士学位