小花棘豆中毒对家兔丘脑-垂体-性腺轴α-甘露糖苷酶的影响

王　帅，陈根元，贾琦珍，张　玲，马春晖,3

(1 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300；2 塔里木大学 动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；3 石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832000)



小花棘豆中毒对家兔丘脑-垂体-性腺轴α-甘露糖苷酶的影响

王帅1,2，陈根元1，贾琦珍1，张玲1,2，马春晖1,3

(1 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300；2 塔里木大学 动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；3 石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832000)

【目的】 探讨小花棘豆中毒对家兔丘脑-垂体-性腺轴α-甘露糖苷酶(AMA)的影响，揭示小花棘豆的毒性作用机理。【方法】 将24只家兔随机分为对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，对照组饲喂青干草，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别饲喂添加15%，30%和45%小花棘豆全草的混合饲料(其苦马豆素含量分别为30，60和90 mg/kg)，分别于攻毒后第14，35和70 天时每组随机采集2只家兔的丘脑、垂体和性腺，检测AMA在家兔丘脑-垂体-性腺轴中的分布、活性及其基因mRNA的表达量。【结果】 AMA在家兔丘脑、垂体和性腺中均有分布，小花棘豆中毒可导致家兔丘脑-垂体-性腺轴AMA活性和分布明显下降。试验组及对照组家兔丘脑-垂体-性腺轴高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(AMA1)和溶酶体α-甘露糖苷酶(AMA2)均有表达，但各试验组表达转录水平总体低于对照组，攻毒第70天时试验Ⅰ组家兔丘脑-垂体-性腺轴的AMA1和AMA2，试验Ⅱ组家兔丘脑-垂体-性腺轴及试验Ⅲ组家兔丘脑和垂体中AMA2的表达均与对照组差异不显著(P>0.05)；试验Ⅲ组家兔丘脑-垂体-性腺轴和试验Ⅱ组家兔丘脑、垂体、睾丸中AMA1 mRNA表达量均极显著低于对照组(P<0.01)，试验Ⅱ组卵巢AMA1 mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05)，试验Ⅲ组家兔睾丸和卵巢AMA2 mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05)。【结论】 小花棘豆中毒可影响家兔丘脑-垂体-性腺轴AMA的活性及其基因的转录表达。

小花棘豆；苦马豆素；α-甘露糖苷酶；丘脑-垂体-性腺轴

小花棘豆是广泛分布于新疆天然草原的有毒植物之一，具有耐旱、耐贫瘠、返青早、生命力强、繁殖系数高等特点，已严重危害新疆草原畜牧业的发展[1]。目前仅南疆阿克苏、和田地区广泛丛生小花棘豆的草场面积已超过20%，每年因采食小花棘豆而中毒的家畜占放牧家畜总数的5%～10%，其中约50%的中毒家畜死亡。中毒家畜表现为机体的广泛性损伤，其中尤以神经系统和繁殖系统最为明显[2]。国内外研究发现，苦马豆素(Swainsonine，SW)是小花棘豆的主要毒性成分[3]，其可通过抑制α-甘露糖苷酶(α-Mannosidase，AMA)活性，导致机体甘露糖代谢发生异常而表现出毒性作用[4-5]。AMA按其在亚细胞器中的分布可分为高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(AMA1)和溶酶体α-甘露糖苷酶(AMA2)等，AMA活性是动物小花棘豆中毒特异性最强的指标[6]，中毒动物的AMA活性受到明显抑制，但中毒对其基因转录、翻译、加工修饰等的影响尚不清楚，而且中毒动物繁殖系统AMA活性及表达的变化也未见相关报道。本试验以新疆南疆地区小花棘豆为试验材料，采用ELISA、免疫组化和荧光实时定量PCR法研究了小花棘豆攻毒对家兔丘脑-垂体-性腺轴AMA活性、分布及其基因mRNA表达的影响，为小花棘豆的中毒机制研究提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

家兔24只，雌雄各半，体质量(2.0±0.1) kg/只，均由塔里木大学动物科学学院实验站提供。

小花棘豆，2014年6月下旬采集于阿克苏市乌什县奥特贝希乡，由塔里木大学动物科学学院草业科学学科组鉴定。取植株的地上部分，阴干、保存备用。

AMA检测试剂盒和S-P超敏组化试剂盒，南京建成生物技术有限公司产品；总RNA提取试剂Trizol、反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒Hot-start PCR Mix、实时荧光定量PCR试剂盒SYBR®Premix ExTaqTMⅡ，均为美国Thermo公司产品；其余试剂均为国产分析纯。试验用水为超纯水。

5331型PCR仪、Realplex2型实时荧光定量PCR仪，德国Eppendorf；PowerWave XS型全波长酶标仪，美国BIO-RAD；DYY-Ⅱ型电泳仪，北京六一；PRO250型组织匀浆仪，美国Pro Scientific；GELDOC-IT型凝胶成像分析仪，美国UVP。

1.2试验动物分组与处理

将24只家兔随机分为对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组6只，雌雄各半，分笼饲养，自由采食和饮水。对照组家兔饲喂青干草，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组家兔分别饲喂含15%，30%和45%粉碎小花棘豆的混合饲料(SW含量分别为30，60和90 mg/kg)攻毒。试验持续70 d。分别在攻毒后第14，35和70天每组随机取雄兔和雌兔各1只，剖杀后分别取丘脑、垂体和性腺(睾丸或卵巢)，各组织部分进行免疫组化染色分析；部分利用冰生理盐水制成100 g/L的组织匀浆液用于AMA活性检测；部分组织液氮保存，用于检测mRNA水平表达的影响。所有解剖工具及冻存管均预先用DEPC水处理。

1.3小花棘豆对家兔丘脑-垂体-性腺轴中AMA分布的影响

家兔丘脑、垂体、睾丸和卵巢组织均使用体积分数4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明后进行石蜡包埋。对包埋组织进行连续切片，片厚6 μm，二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，然后按照试剂盒说明进行免疫组化染色，其中生物素标记的第二抗体稀释比为1∶100，DAB显色。常规脱水，透明，封片，光镜下观察组织病理学变化，采用Image-Pro Plus 6.0软件对免疫组化获得照片进行分析。

1.4小花棘豆对家兔丘脑-垂体-性腺轴中AMA活性的影响

按照南京建成家兔血清AMA活性检测试剂盒说明书，采用间接ELISA法测定家兔丘脑-垂体-性腺轴组织中的AMA活性。

1.5小花棘豆对家兔丘脑-垂体-性腺轴中AMA基因mRNA表达水平的影响

1.5.1引物设计与合成根据GenBank中家兔AMA1、AMA2和β-actin基因的核苷酸序列(GenBank登录号分别为：NM_012979.2、NM_174561.2和NM_007393.2)，采用Beacon Designer软件设计引物，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，相关信息见表1。

1.5.2总RNA的提取与cDNA合成参照Thermo公司总RNA提取试剂Trizol的说明书提取家兔待测组织总RNA，用核酸蛋白检测仪测定其OD260和RNA浓度，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。利用gDNA Eraser去除合格RNA中的基因组DNA，反应条件：42 ℃ 2 min。以除去基因组DNA的RNA为模板，用反转录试剂盒采用两步法进行反转录，合成cDNA。

表 1　试验所用引物序列Table 1　Primer sequence in the test

1.5.3普通PCR及基因测序参照Thermo公司PCR扩增试剂盒Hot-start PCR Mix的说明书进行PCR反应，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增阳性者送宝生物工程(大连)有限公司测序。

1.5.4家兔组织中AMA相对表达量的实时荧光定量PCR检测采用SYBR®Premix ExTaqTMⅡ进行实时荧光定量PCR反应，采用双标准曲线法对所得实时荧光定量PCR结果进行分析。

1.6数据分析

试验数据使用SPSS 16.0软件中One-Way ANOVA方法进行单因素方差分析。

2　结果与分析

2.1AMA在家兔丘脑-垂体-性腺组织中的分布

结果表明，AMA在对照组家兔分布于丘脑旁中央核、室旁核、背内侧核、腹内侧核(图1-A)，垂体前叶、后叶、正中隆起(图1-B)，睾丸精曲小管、精直小管、间质细胞(图1-C)及卵巢上皮细胞、绒毛细胞、颗粒层细胞(图1-D)等区域。小花棘豆攻毒第35 天时，家兔丘脑背内侧核细胞、丘脑室旁核、垂体前叶和后叶、睾丸间质细胞及卵巢绒毛细胞中AMA分布明显下降；第70天时试验Ⅱ和Ⅲ组家兔丘脑室旁核(图1-E)、垂体前叶(图1-F)、睾丸间质细胞(图1-G)和卵巢绒毛细胞(图1-H)中AMA免疫组化染色极淡，表明这些区域AMA已几乎不表达。

2.2家兔丘脑-垂体-性腺轴中AMA活性的变化

在整个试验期内，对照组家兔丘脑-垂体-性腺AMA活性无明显变化，试验组家兔丘脑-垂体-性腺AMA活性均有一定程度的下降。由表2可知，攻毒第14天时，试验Ⅲ组家兔丘脑、垂体AMA活性显著低于对照组(P<0.05)，但睾丸和卵巢组织AMA活性与对照组差异均不显著(P>0.05)。攻毒第35天时，试验Ⅲ组家兔丘脑-垂体-性腺AMA活性均极显著低于对照及试验Ⅰ、Ⅱ组(P<0.01)。攻毒第70天时试验Ⅲ组家兔丘脑-垂体-性腺轴AMA活性均极显著低于对照组(P<0.01)；试验Ⅱ组丘脑、垂体、睾丸AMA活性均极显著低于对照组(P<0.01)，卵巢AMA活性显著低于对照组(P<0.05)；试验Ⅰ组丘脑AMA活性极显著低于对照组(P<0.01)，垂体AMA活性显著低于对照组(P<0.05)，睾丸和卵巢AMA活性与对照组差异不显著(P>0.05)。结果表明，长时间、高剂量地摄食小花棘豆可显著影响家兔丘脑-垂体-性腺轴中AMA的活性，其中丘脑受到的影响最为明显。

图 1　小花棘豆中毒对家兔AMA在丘脑-垂体-性腺轴分布的影响(IHC×400) A、B、 C、 D.分别为对照组丘脑、垂体、睾丸、卵巢组织；E、F、G、H.分别为攻毒第70 天时试验Ⅲ组丘脑、垂体、睾丸、卵巢组织Fig.1　Effects of Oxytropis glabra DC poisoning on distribution of AMA in hypothalamus- pituitary-gonad of rabbits (IHC×400) A,B,C and D were distribution of AMA in hypothalamus,pituitary,testis and ovary in control group,E,F,G and H were distribution of AMA in hypothalamus,pituitary,testis and ovary in experimental group Ⅲ in 70 d表 2　小花棘豆中毒对家兔丘脑-垂体-性腺轴中AMA活性的影响Table 2　Effects of Oxytropis glabra DC poisoning on activities of AMA in hypothalamus-pituitary-gonad of rabbits　nmol/(s·L)

表 2(续)　Continued table 2

注：同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

Note:Different small letters indicate significant difference (P<0.05),and different capital letters indicate very significant difference (P<0.01).The same below.

2.3小花棘豆对家兔丘脑-垂体-性腺轴AMAmRNA表达水平的影响

2.3.1引物的特异性验证普通PCR结果如图2所示。由图2可看出，β-actin在100 bp左右出现条带，AMA1和AMA2基因分别在100 和200 bp间出现2条清晰条带，与试验预期的目的条带长度相符，表明引物特异性良好。测序结果表明，β-actin、AMA1和AMA2基因的序列都与预期的片段长度基本一致，且与 GenBank 中的物种序列进行比对后，AMA1和AMA2基因与家兔序列的相似性均在 96%以上。

图 2　家兔β-actin、AMA1和AMA2 基因的PCR扩增M.DNA Marker；1.AMA1扩增产物； 2.AMA2扩增产物；3.β-actin扩增产物Fig.2　PCR amplification of β-actin,AMA1 andAMA2 genes in rabbitsM.DNA Marker；1.AMA1 amplification products；2.AMA2 amplification products；3.β-actin amplification products

2.3.2AMA1 mRNA的表达水平由表3可知，各试验组家兔丘脑-垂体-性腺中AMA1均有表达。攻毒第14天时，试验Ⅲ组家兔AMA1 mRNA在丘脑中表达量较对照组显著下降(P<0.05)，而垂体、睾丸和卵巢中的表达量均与对照组差异不显著(P>0.05)；试验Ⅰ和Ⅱ组家兔丘脑-垂体-性腺中AMA1 mRNA表达量均与对照组差异不显著(P>0.05)。攻毒第35天时，试验Ⅲ组家兔丘脑-垂体-性腺轴中AMA1 mRNA表达量均极显著低于对照组(P<0.01)；试验Ⅱ组家兔丘脑的表达量极显著低于对照组(P<0.01)，垂体的表达量显著低于对照组(P<0.05)；试验Ⅰ组的表达量与对照组差异不显著(P>0.05)。攻毒第70天时，试验Ⅲ组家兔丘脑-垂体-性腺中AMA1 mRNA表达量极显著低于对照组(P<0.01)；试验Ⅱ组家兔丘脑、垂体和睾丸中的表达量极显著低于对照组(P<0.01)，而卵巢的表达量显著低于对照组(P<0.05)；试验Ⅰ组家兔的表达量与对照组差异不显著(P>0.05)。试验结果表明，大剂量、长时间饲喂小花棘豆可显著影响家兔丘脑-垂体-性腺轴中AMA1 mRNA的表达水平。

2.3.3AMA2 mRNA的表达水平由表4可知，AMA2在各试验组家兔丘脑-垂体-性腺轴中均有表达。与对照组相比，攻毒第14和35 天时，试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组家兔丘脑-垂体-性腺轴中AMA2 mRNA表达量均与对照组差异不显著(P>0.05)。攻毒第70天时，试验Ⅲ组家兔睾丸和卵巢组织中AMA2 mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05)，而丘脑和垂体组织中的表达量与对照组差异不显著(P>0.05)；试验Ⅰ和Ⅱ组家兔丘脑-垂体-性腺轴中AMA2 mRNA表达量与对照组差异不显著(P>0.05)。结合表3结果可知，小花棘豆中毒对家兔丘脑-垂体-性腺轴中AMA1 mRNA表达量的影响较为显著，对AMA2 mRNA表达量的影响不明显。

表 3　小花棘豆中毒对家兔丘脑-垂体-性腺轴中AMA1基因mRNA相对表达量的影响Table 3　Effects of Oxytropis glabra DC poisoning on relative expressions of AMA1 mRNA in hypothalamus-pituitary-gonad of rabbits

3　讨　论

SW是小花棘豆的主要毒性成分，可强烈地、特异性地与AMA结合，从而使机体甘露糖代谢发生异常，导致甘露糖在细胞中大量蓄积而造成细胞空泡变性，最终导致细胞损伤[7]。贾琦珍等[8]研究表明，小花棘豆中毒可导致家兔脑组织与性腺损伤，而且脑指数、睾丸指数、卵巢指数与小花棘豆中毒均极显著相关(P<0.01)。丁伯良等[9-10]研究认为，甘肃棘豆(主要毒性成分为SW)中毒山羊睾丸、附睾、卵巢、胎盘组织细胞的空泡变性与AMA活性下降有关。本试验发现，AMA在家兔丘脑-垂体-性腺轴中均有分布，但在小花棘豆中毒家兔该组织中的AMA活性显著下降，而且与时间-剂量呈正相关，表明SW可通过影响AMA导致动物中毒。

AMA在机体糖蛋白合成和代谢方面具有重要的作用，可在N-糖基化过程中对甘露糖进行加工。该过程与蛋白的折叠、运输、成熟、构象维持、半衰期及生物活性密切相关。AMA既是N-聚糖成熟的必要酶，也参与N-聚糖的降解[11]。荣杰[5]、宋岩岩[12]研究发现，SW可显著影响大鼠AMA在脑组织中的相对表达量；张建军等[13]研究发现，小花棘豆中毒可显著影响小鼠肝脏组织内AMA的相对表达量，中、高剂量攻毒组可显著降低肝脏组织内的AMA基因的相对表达量。本试验结果发现，小花棘豆毒性成分SW可显著影响家兔丘脑-垂体-性腺轴中AMA1和AMA2在mRNA水平的表达量，而且其对AMA1 mRNA表达量的影响更为显著，该结果与文献[5,12-13]的研究结果一致。另外免疫组化试验发现，小花棘豆中毒家兔丘脑-垂体-性腺轴中AMA分布均有一定程度的下降。AMA按其在亚细胞器中的分布可分为AMA1、AMA2和细胞质α-甘露糖苷酶，动物小花棘豆中毒主要抑制哪种AMA尚不明确，对其转录、翻译、加工修饰是否产生影响还不清楚。本试验结果表明，小花棘豆毒性成分可从mRNA水平和蛋白表达水平影响AMA的表达，这为揭示小花棘豆中毒的机理奠定了基础。

丘脑和垂体是动物内分泌的控制中心，并分泌大量与生殖相关的激素，性腺是多种性激素的受体。丘脑-垂体-性腺轴任何部位出现功能紊乱或病变，都会影响动物性激素的分泌，从而导致一系列的临床病症出现。AMA活性受到抑制可导致细胞内糖蛋白的N-糖基化合成、加工、转运等过程发生变化，临床上表现为生殖、内分泌和免疫功能紊乱[14]。本试验结果表明，中、高剂量小花棘豆攻毒对家兔丘脑-垂体-性腺AMA的活性与表达产生显著影响。本项目组前期研究表明，小花棘豆中毒可导致动物性欲下降，其原因是否与中毒导致丘脑-垂体-性腺轴损伤有关有待于进一步研究。

4　结　论

小花棘豆中毒可导致家兔丘脑-垂体-性腺轴AMA活性与表达水平显著下降，而且下降程度与小花棘豆摄入量呈正相关。小花棘豆中毒对AMA1的影响较为显著，其可通过mRNA水平和蛋白表达水平影响AMA1在机体中的作用。

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Effects ofOxytropisglabraDC poisoning on α-mannosidase of Hypothalamus-Pituitary-Gonad in rabbit

WANG Shuai1,2,CHEN Genyuan1,JIA Qizhen1,ZHANG Ling1,2,MA Chunhui1,3

(1KeyLaboratoryofTarimAnimalHusbandryScienceandTechnology,XinjiangProduction&ConstructionCorps,Alar,Xinjiang843300,China;2CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,Alar,Xinjiang843300,China;3CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832000,China)

【Objective】 This study investigated the effects ofOxytropisglabraDC poisoning on content and transcriptional expression of α-mannosidase(AMA) in hypothalamus-pituitary-gonad to reveal its toxicity mechanism.【Method】 A total of 24 rabbits were randomly and equally divided into control group and experimental groups Ⅰ,Ⅱ,and Ⅲ.The control group was feed with green hay only while the experimental groups were fed with mixed forage with 15%,30% and 45% driedO.glabraDC plant and the corresponding swainsonine contents were 30 mg/kg,60 mg/kg,and 90 mg/kg,respectively.Two rabbits were randomly selected from each group on the 14th,35th and 70th days to collect hypothalamus,pituitary and gonad for the measurement of distribution and content of AMA as well as the mRNA expression in different encephalic regions.【Result】 AMA distributed in hypothalamus-pituitary-gonad in rabbits,andO.glabraDC reduced the distribution and content of hypothalamus-pituitary-gonad in experimental groups.AMA in golgi and lysosomal expressed in hypothalamus-pituitary-gonad of all experimental groups,andO.glabraDC reduced the expression of hypothalamus-pituitary-gonad AMA1 and AMA2 mRNA.The difference in AMA1 and AMA2 expressions was not significant between experimental groupⅠand control group in hypothalamus-pituitary-gonad at 70 d (P>0.05),so was the difference in AMA2 expression between experimental groups Ⅱ and Ⅲ with control group.The difference in AMA1 expression was very significant between experimental group Ⅲ and control group in hypothalamus-pituitary-gonad at 70 d(P<0.01),so as the difference between experimental groupⅡ and control group in hypothalamus,pituitary and testis (P<0.01).The difference was not significant between experimental group Ⅱ and control group in ovary (P>0.05),but the difference of AMA2 expression was extremely significant between experimental groupⅢ and control group in testis and ovary (P<0.01).【Conclusion】O.glabraDC had effects on content and transcriptional expression of AMA in rabbit hypothalamus-pituitary-gonad.

OxytropisglabraDC;swainsonine;α-mannosidase;hypothalamus-pituitary-gonad

网络出版时间:2016-07-1208:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.08.007

2015-01-22

国家自然科学基金项目(31460678)；国家星火计划项目(2015GA891015)

王帅(1984-)，男，山西长治人，实验师，硕士，主要从事动物毒理学研究。E-mail:wangshuaidky@126.com

马春晖(1966-)，男，新疆哈密人，教授，博士，博士生导师，主要从事牧草资源开发利用研究。

E-mail:chunhuima@126.com

S856.9

A

1671-9387(2016)08-0041-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160712.0845.014.html