抗人白介素- 17RA单克隆抗体的制备及活性检测

徐真真，孙春昀，谢良志

1中国医学科学院　北京协和医学院　细胞工程中心，北京 1000052神州细胞工程有限公司新药研发部，北京 100176



·论著·

抗人白介素- 17RA单克隆抗体的制备及活性检测

徐真真1，孙春昀2，谢良志1

1中国医学科学院北京协和医学院细胞工程中心，北京 1000052神州细胞工程有限公司新药研发部，北京 100176

目的制备具有中和人白介素- 17RA(hIL- 17RA)免疫活性的单克隆抗体，并探讨其生物学活性。方法通过基因工程技术制备抗hIL- 17RA的单克隆抗体。采用OctetRED系统检测其亲和力，ELISA、Western blot和流式细胞术分析抗体的结合作用和种属交叉反应，人包皮成纤维细胞- 1上细胞因子分泌实验检测抗体的中和活性。结果抗hIL- 17RA单克隆抗体亲和力常数KD<1.0×10-12mol/L，并与其他物种有一定的交叉结合反应，它能结合白介素(IL)- 17RA并有效阻断其与配体的结合，抑制下游相关细胞因子IL- 6、IL- 8和人CXC趋化因子配体1的分泌。结论成功制备1株抗hIL- 17RA的中和抗体，为IL- 17RA相关疾病通路的研究提供了工具，也为IL- 17RA靶点药物的开发奠定了一定的基础。

白介素- 17RA；白介素- 17A；白介素- 17F；抗体；人包皮成纤维细胞- 1

ActaAcadMedSin，2016,38(4)：428-433

目前，白介素(interleukin，IL)- 17超家族包括6个配体(IL- 17A～IL- 17F)和5个受体(IL- 17RA～IL17 RE)。IL- 17A最早在1993年发现，当时命名为CTLA8。其受体IL- 17RA于两年后确认，且与以往发现的细胞因子受体家族无同源性[1]。IL- 17受体家族成员都是一型单次跨膜蛋白，具有保守结构基序，包括胞外的类纤维结合素Ⅲ结构域、跨膜结构域和一个胞内的SEF/IL- 17R (SEFIR)结构域。IL- 17A主要由CD4+T细胞分化的一种新的T辅助细胞亚群TH17产生[2]。人类的IL- 17A与IL- 17F可以借助二硫键形成同源或异源二聚体，与表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞等表面的IL- 17RA～IL- 17RC受体复合物结合[3]，通过IL- 17RA胞内区段SEFIR募集衔接蛋白ACT1[4]，形成IL- 17RA-Actl-TRAF6信号复合物，激活下游通路，诱导炎性因子IL- 6、IL- 8、CXCL1等的表达分泌，并募集动员中性粒细胞，导致各种炎症疾病的发生[5- 6]。大多自身免疫病和炎症相关性疾病如银屑病、风湿性关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化、呼吸道疾病及炎性肠病等都与IL- 17通路密切相关，阻断IL- 17通路是治疗此类疾病的一种新途径，相关研究已成为医学及免疫学研究的热点，特别是针对IL- 17A靶点的抗体已经在很多疾病上呈现出显著的疗效。但有的疾病如肠炎性疾病仅阻断IL- 17A通路不能达到理想的效果，需要联合阻断IL- 17A和IL- 17F。IL- 17RA作为目前已知4种配体(IL- 17A、IL- 17F、IL- 17C、IL- 17E)的受体，涉及更为广泛的信号转导和生物功能。本研究拟制备具有中和活性的抗人IL- 17RA单克隆抗体，用以IL- 17相关生物学功能研究的工具试剂，并为IL- 17RA靶点抗体药物的开发奠定基础。

材料和方法

材料人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblast cells，HFF)- 1(ATCC)；IL- 6 ELISA定量检测试剂盒、HEK- 293E细胞系、IL- 17A、IL- 17A/F、IL- 17F、人白介素(human interleukin，hIL)- 17RA、鼠白介素(mouse interleukin，mIL)- 17RA、猴白介素(cynomolgus interleukin，cynoIL)- 17RA (北京义翘神州生物技术有限公司，Sino Biological)；IL- 8 ELISA定量检测试剂盒(北京欣博盛生物技术有限公司)；CXCL1 ELISA定量检测试剂盒(美国R&D)；TRIzol试剂 (美国Invitrogen)；链霉亲和素探针，OctetRED生物分子相互作用系统(美国Pall Corporation)；凝胶图象分析系统ChampGel- 1000(北京赛智创业科技有限公司)；FACSCalibur(美国BD)；酶标仪Multiskan MK3(美国Thermo)；Odyssey红外荧光扫描成像系统(美国LI-COR)。

hIL- 17RA抗体的制备用获得的hIL- 17RA重组蛋白抗原与佐剂按照1∶1的比例充分混合乳化后，对兔子皮下分点注射进行免疫。取4次免疫的血清抗体滴度合格的兔子脾脏和骨髓构建免疫抗体文库。用TRIzol法提取脾脏骨髓中的总RNA，通过反转录PCR合成cDNA，然后用兔抗体引物对组合扩增获得抗体的轻链和重链可变区，之后将重轻链可变区连接起来并插入到pComb3噬菌体外壳蛋白结构基因Ⅲ上，构建成噬菌体载体质粒，转入大肠杆菌中表达扩增获得噬菌体抗体库。采用hIL- 17RA重组蛋白淘洗筛选得到特异性结合的阳性克隆，获得阳性克隆基因序列，构建完整兔抗体表达质粒。将抗体表达质粒转染对数生长期的HEK- 293E细胞，培养表达数天后，离心取上清过滤纯化。将通过蛋白A柱纯化捕获得到的抗体进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析。

hIL- 17RA抗体的亲和力分析先将标记生物素的hIL- 17RA稀释到终浓度为4 μg/ml的溶液，再将待检的hIL- 17RA抗体梯度稀释为4、2、1 μg/ml。将PBS缓冲液、生物素标记的hIL- 17RA、PBS缓冲液、hIL- 17RA待检抗体、PBS稀释缓冲液按照OCTET仪器预设的程序250 μl/孔依次点样后上机检测。

hIL- 17RA抗体竞争活性分析分别以1 μg/ml的hIL- 17A，10 μg/ml的hIL- 17A/F和hIL- 17F包被酶标板，100 μl/孔，4℃过夜。次日将hIL- 17RA特异性抗体梯度稀释后加样。同时将生物素标记的hIL- 17RA以0.5、0.5、5 μg/ml分别加入到对应的包被hIL- 17A、hIL- 17A/F和hIL- 17F的孔中，100 μl/孔，室温孵育2 h。最后加入1 μg/ml的辣根过氧化物酶标记的链亲和素(北京中杉金桥生物技术有限公司)，100 μl/孔，室温作用1 h后显色，450 nm处读取光密度(optical density，OD)值。

hIL- 17RA抗体对抗原结合的流式分析通过流式分析研究hIL- 17RA抗体对细胞膜上天然蛋白hIL- 17RA的结合作用。将HFF- 1细胞消化离心后分别与浓度为1和0.333 μg/ml的hIL- 17RA抗体孵育20 min后，用1 ml洗液(含1%牛血清白蛋白的pH7.4的PBS缓冲液)洗两遍，再加入生物素标记的hIL- 17A孵育45 min后用1 ml洗液洗两遍。最后加入荧光二抗 (Alexa Fluor®488标记的链霉亲和素，美国Life Technologies公司)，4℃孵育30 min后离心弃上清，洗液重悬，400目筛网过滤细胞样品到流式管中上机检测(实验中设置阳性对照和阴性对照：阴性对照中细胞只与二抗孵育；阳性对照中细胞与生物素标记的hIL- 17A蛋白孵育后再与二抗孵育；实验组中细胞先与待检抗体孵育，再加入生物素标记的hIL- 17A蛋白孵育，最后加入二抗孵育)。

hIL- 17RA抗体的交叉结合反应通过Western blot和ELISA分别从线性表位和构象表位上鉴定hIL- 17RA抗体与不同物种IL- 17RA的交叉结合。3种重组蛋白分别为hIL- 17RA、cyno IL- 17RA和mIL- 17RA。

Western blot：将20 ng/ml的hIL- 17RA、20 ng/ml的cynoIL- 17RA、200 ng/ml的mIL- 17RA和阴性对照分别进行SDS-PAGE 电泳后加入抗hIL- 17RA单抗孵育。最后加入山羊抗兔二抗[DyLight800标记的抗兔 IgG (H+L)抗体，美国KPL公司]扫描成像。

ELISA：分别将3种蛋白稀释至0.05 μg/ml，100 μl/孔包被酶标板，4℃过夜。次日，加入2 μg/ml的待检hIL- 17RA抗体孵育1 h，再加入辣根过氧化物酶标记的IgG/Fc特异性的山羊抗兔二抗(美国Jackson公司)，室温孵育1 h后显色，OD 450 nm处读值。

hIL- 17RA抗体中和活性的细胞实验将处于生长对数期的HFF- 1细胞以1×104/孔接种于96孔细胞培养板中。次日，10 μl/孔加入梯度稀释的不同浓度的hIL- 17RA抗体后，分别加入终浓度为50 ng/ml的hIL- 17A、1 μg/ml的hIL- 17A/F、1 μg/ml的hIL- 17F配体刺激，37℃、5% CO2培养箱中孵育48 h后双抗夹心ELISA法检测培养上清中的IL- 6、IL- 8和CXCL1的分泌量。ELISA检测方法按照定量酶联检测试剂盒中的说明书进行。中和率(%)=[1-(不同抗体浓度时的因子分泌量-阴性对照)/(阳性对照-阴性对照)]×100%。

结　　果

hIL- 17RA抗体电泳分析结果纯化获得的抗体经SDS-PAGE电泳分析显示，非还原电泳中出现的条带与单克隆抗体的相对分子质量相符；还原电泳中可见两条清晰条带，分别是二硫键打开后的重链和轻链所对应的相对分子质量(图1)。

hIL- 17RA抗体的亲和活性通过OCTET生物分子相互作用仪对抗hIL- 17RA单克隆抗体与抗原hIL- 17RA的亲和力进行研究，结果显示抗hIL- 17RA单克隆抗体的结合速率Kon(1/Ms)为3.73×105，解离速率Kdis(1/s)<1.0×10-7，在不同浓度条件下，亲和力常数KD值都<1.0×10-12mol/L (检测最小限)，抗hIL- 17RA单克隆抗体具有较强的亲和活性(图2)。

hIL- 17RA抗体竞争结合活性通过ELISA实验分析hIL- 17RA抗体与hIL- 17RA配体竞争结合hIL- 17RA的活性，结果显示不同浓度的hIL- 17RA抗体可以与hIL- 17A、hIL- 17A/F、hIL- 17F竞争结合hIL- 17RA，抗体的百分竞争率随着抗体浓度的升高而升高(图3)。

hIL- 17RA抗体对天然蛋白的结合作用流式分析hIL- 17RA抗体对细胞膜上天然蛋白hIL- 17RA的结合作用，结果显示实验组中加入hIL- 17RA抗体孵育后(黑色线条)的荧光强度比阳性对照组(黑色阴影)的荧光强度减弱，左移偏向阴性对照组(灰色线条)(图4)。

IL- 17RA：白介素- 17受体A；SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；Mr：相对分子质量；1、4：IL- 17RA抗体；2、3：marker

IL- 17RA：interleukin- 17 receptor A；SDS-PAGE：sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；Mr： relative molecular mass；1,4：IL- 17RA antibody；2，3：marker

A.非还原电泳；B.还原电脉

A.non-reducing SDS-PAGE;B.reducing SDS-PAGE

图 1IL- 17RA抗体的SDS-PAGE分析

Fig 1SDS-PAGE analysis of IL- 17RA antibody

hIL- 17RA抗体的交叉结合反应Western blot结果显示，在hIL- 17RA、cynoIL- 17RA处出现明显结合条带，在阴性对照和mIL- 17RA处无条带(图5)。ELISA实验数据显示，空白组OD平均值为0.050，3个物种重组蛋白与抗体的结合OD平均值分别为2.640、2.199、2.383(图6)。OD值高低与结合强弱呈正相关。

hIL- 17RA抗体在细胞上的中和活性ELISA检测分泌的蛋白水平对hIL- 17RA抗体的中和活性显示，在不加入配体刺激时(基准值，阴性对照)，细胞的炎性因子IL- 6、IL- 8和CXCL1的分泌量很低；加入配体hIL- 17A、hIL- 17A/F、hIL- 17F刺激后(阳性对照，抗体浓度为0时)，3种炎性因子分泌量明显升高；同时加入浓度为0.64、3.20、16、80、400、2000、10 000 ng/ml的hIL- 17RA中和抗体后，炎性因子分泌量随着抗体浓度的升高而逐渐降低，并且成浓度梯度依赖性(图7)。在细胞分泌的蛋白水平上，抗hIL- 17RA单克隆抗体可以结合到细胞表面的hIL- 17RA受体上，中和其配体hIL- 17A、hIL- 17A/F、hIL- 17F诱导HFF- 1细胞产生的炎性因子IL- 6、IL- 8和CXCL1的分泌，且最高中和率达90%左右。

图 2抗体亲和力的OCTET结合和解离曲线

Fig 2Affinity curve of IL- 17RA antibody detected by OCTET

图 3IL- 17RA抗体的竞争结合活性分析

Fig 3Competition binding analysis of IL- 17RA antibody

黑色线条：依次加入hIL- 17RA抗体、生物素标记的hIL- 17A蛋白和二抗孵育的实验组；黑色阴影：与生物素标记的hIL- 17A蛋白和二抗孵育的阳性对照组；灰色线条：只与二抗孵育的阴性对照组

black line： experiment group incubated with hIL- 17RA antibody，biotin-conjugated hIL- 17A and second antibody in sequence；black shadow： positive control group with biotin-conjugated hIL- 17A and second antibody in sequence；gray line： negative control group only incubated with second antibodyA. hIL- 17RA抗体 (1 μg/ml)；B. hIL- 17RA抗体(0.333 μg/ml)

A. hIL- 17RA antibody(1 μg/ml)；B.hIL- 17RA antibody(0.333 μg/ml)

图 4IL- 17RA抗体的流式分析

Fig 4Analysis of IL-17RA antibody by fluorescence-activated cell sorter

M:marker;1：人IL- 17RA；2：鼠IL- 17RA;3：猴IL- 17RA;4：牛血清白蛋白(阴性对照)

M:marker;1： human IL- 17RA；2： mouse IL- 17RA；3：cynomolgus IL- 17RA；4： bull serum albumin (negative control)

图 5抗体交叉结合反应的蛋白印迹分析

Fig 5The species cross-reactivity of antibody was identified by Western blot

图 6抗体交叉结合反应的ELISA分析

Fig 6The species cross-reactivity of antibody was identified by ELISA analysis

阴性对照(基准值)：空细胞；阳性对照(抗体浓度为0)：只加配体孵育

negative control(baseline)：null cells；positive control(without antibody)： only incubated with ligands

A.IL- 6；B.IL- 8；C.CXCL1

图 7IL- 17RA 抗体的中和活性分析

Fig 7Neutralizing activity analysis of IL- 17RA antibody

讨　　论

目前很多中和IL- 17A的单克隆抗体已进入临床研究阶段[7]，诺华的Secukinumab对于银屑病适应证的新药申请已在欧洲批准上市。但是针对IL- 17RA靶点的药物尚不多见。近年有研究表明，只使用针对IL- 17A靶点的单抗，对于克罗恩病无效，而且相对于安慰剂，还有一定的不良反应[8]。如果同时封闭IL- 17A和IL- 17F，而不是单独中和IL- 17A或IL- 17F，可以改善减轻早期肠炎患者的痛苦[9]。在由吸烟导致的慢性阻塞性肺炎中，气道的中心和远端部位IL- 17A、IL- 17F均有所升高，上皮细胞这两个因子及其受体IL- 17R的升高也有着不可忽视的作用[10- 11]。另有研究显示，慢性牙周炎患者的牙龈组织中IL- 17A和IL- 17F的mRNA水平比健康人高，而且IL- 17F和IL- 17A作用相似，可以诱导人牙龈成纤维细胞中核因子-κB中p65和细胞外信号调节激酶的磷酸化，使重要炎性因子IL- 6、CXCL8和CCL20的分泌量增加[12]，表明IL- 17A和IL- 17F在慢性牙周炎的发病机制中发挥重要的作用。以上这些均表明只针对单一配体IL- 17A或IL- 17F靶点的单抗尚不足以对很多炎症性病变有效，这就需要一个能封闭多因子的靶点中和抗体发挥作用。IL- 17RA抗体可以结合到IL- 17RA上，不仅可以阻断IL- 17A与IL- 17RA的结合，同时也可以阻断IL- 17F及其二聚体与IL- 17RA受体的结合，作用范围更广。

本研究首先构建表达hIL- 17RA抗原，然后免疫动物获得抗hIL- 17RA单克隆抗体。该单抗在非还原电泳中出现了一条稍离散的条带，稍微离散的条带经高效液相色谱法和质谱分析由重链糖基化造成。抗体与细胞膜上天然蛋白IL- 17RA结合的实验中，阳性对照荧光强度不够强可能是因为hIL- 17A相对分子质量太小，不容易标记所致。实验结果与预期相符：hIL- 17RA抗体阻断了hIL- 17A与hIL- 17RA的结合，故而荧光信号减弱，间接表明抗hIL- 17RA单克隆抗体能够与细胞膜上天然蛋白hIL- 17RA结合。竞争结合抗hIL- 17RA单克隆抗体的百分竞争率越高，表明其与hIL- 17RA竞争结合活性越高。该高亲和力单抗的交叉结合结果表明本研究制备的抗体不仅与猴蛋白的线性表位有交叉结合，而且与猴和鼠蛋白的构象表位均有交叉结合反应，这预示着抗hIL- 17RA单克隆抗体可与其他物种天然蛋白结合，为以后的动物药效实验起到了一定的指导作用。另外，抗hIL- 17RA单克隆抗体还具备较好的生物活性，能够明显阻断hIL- 17A、hIL- 17A/F、hIL- 17F与其细胞膜上受体hIL- 17RA的结合，有效抑制3个配体诱导的炎性因子IL- 6、IL- 8、CXCL1的分泌。IL- 17RA受体共有4个配体，抗hIL- 17RA单克隆抗体对于其他配体下游通路的阻断作用尚有待继续研究。

综上，本研究成功制备得到1株具有优良生物活性的抗人IL- 17RA的中和抗体，该中和单抗的成功制备，为IL- 17RA靶点相关通路的研究提供了科研工具，也为后期药物的进一步开发奠定了良好基础。

[1]Gaffen SL. Structure and signalling in the IL- 17 receptor family[J]. Nat Rev Immunol，2009，9(8)： 556- 567.

[2]Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR，et al. Interleukin 17-producing CD4+effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages [J]. Nat Immunol，2005，6(11)： 1123- 1132.

[3]Hu Y，Ota N，Peng I，et al. IL- 17RC is required for IL- 17A- and IL- 17F-dependent signaling and the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis [J]. J Immunol，2010，184(8)： 4307- 4316.

[4]Chang SH，Park H，Dong C. Act1 adaptor protein is an immediate and essential signaling component of interleukin- 17 receptor [J]. J Biol Chem，2006，281(47)： 35603- 35607.

[5]Wright JF，Bennett F，Li B，et al. The human IL- 17F/IL- 17A heterodimeric cytokine signals through the IL- 17RA/IL- 17RC receptor complex [J]. J Immunol，2008，181(4)： 2799- 2805.

[6]Song X，Qian Y. The activation and regulation of IL- 17 receptor mediated signaling [J]. Cytokine，2013，62(2)： 175- 182.

[7]Chiricozzi A，Krueger JG. IL- 17 targeted therapies for psoriasis [J]. Expert Opin Investig Drugs，2013，22(8)： 993- 1005.

[8]Hueber W，Sands BE，Lewitzky S，et al. Secukinumab，a human anti-IL- 17A monoclonal antibody，for moderate to severe Crohn’s disease： unexpected results of a randomised，double-blind placebo-controlled trial [J]. Gut，2012，61(12)： 1693- 1700.

[9]McLean LP，Cross RK，Shea-Donohue T. Combined blockade of IL- 17A and IL- 17F may prevent the development of experimental colitis [J]. Immunotherapy，2013，5(9)： 923- 925.

[10]Chang Y，Al-Alwan L，Alshakfa S，et al. Upregulation of IL- 17A/F from human lung tissue explants with cigarettesmoke exposure： implications for COPD [J]. Respir Res，2014，15(1)： 145.

[11]Montalbano AM，Riccobono L，Siena L，et al. Cigarette smoke affects IL- 17A，IL- 17F and IL- 17 receptor expression in the lung tissue：Exvivoandinvitrostudies [J]. Cytokine，2015，76(2)： 391- 402.

[12]Luo Z，Wang H，Chen J，et al.Overexpression and potential regulatory role of IL- 17F in pathogenesis of chronic periodontitis[J]. Inflammation，2015，38(3)：978- 986.

Preparation and Activity Detection of A Novel Monoclonal Antibody to Human Interleukin- 17RA

XU Zhen-zhen1，SUN Chun-yun2，XIE Liang-zhi1

1Cell Engineering Center，CAMS and PUMC，Beijing 100005，China2New Drug R&D Department，Sinocelltech Ltd.，Beijing 100176，China

XIE Liang-zhiTel：010- 51029808，E-mail：liangzhi@yahoo.com

ObjectiveTo develop a neutralizing antibody to human interleukin- 17RA (hIL- 17RA) and investigate the biological activity of the antibody.MethodsThe anti-hIL- 17RA antibody was produced by recombinant technology while its binding affinity to hIL- 17RA was measured by OctetRED system. The antibody’s blocking activity to hIL- 17RA and cross-reaction between species were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay，Western blot，fluorescence activated cell sorter，while its neutralization activity was measured by inhibiting the secretion of cytokine in human foreskin fibroblast cells- 1. ResultsThe antibody’s affinity constant was less than 1.0×10-12mol/L，with certain cross-reaction among species. Secretion of interleukin(IL)- 6，IL- 8，and chemokine(CXC motif) ligand 1 elicited by IL- 17A，IL- 17A/F，and IL- 17F in human foreskin fibroblast cells- 1 was neutralized by the antibody.ConclusionA novel neutralizing antibody to hIL- 17RA was obtained，which provides research tools for studying hIL- 17RA signal pathways and lays a foundation for drug development targeting hIL- 17RA.

interleukin- 17RA；interleukin- 17A；interleukin- 17F；antibody；human foreskin fibroblast cells- 1

十二五“重大新药创制”科技重大专项(2013ZX09402301) Supported by the Key Project of the “Twelfth Five-year Plan ”for Medical Science Development of China (2013ZX09402301)

谢良志电话：010- 51029808，电子邮件：liangzhi@yahoo.com

R915

A

1000- 503X(2016)04- 0428- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.04.011

2016- 03- 04)