miR-21对人喉鳞癌Hep2细胞增殖与凋亡的影响

曲　莉

(南阳市中心医院耳鼻喉二病区，河南南阳 473000)



miR-21对人喉鳞癌Hep2细胞增殖与凋亡的影响

曲莉

(南阳市中心医院耳鼻喉二病区，河南南阳 473000)

目的探讨miR-21对人喉鳞癌Hep2细胞增殖与凋亡的影响。方法脂质体LipofectamineTM2000将miR-21 inhibitor和miR-21阴性对照(NC)转入Hela细胞，四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力，克隆实验及Hoechst染色分别检测细胞增殖与凋亡情况，Western blot检测人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)、程序化死亡蛋白4基因(PDCD4)、Bax、Bcl-2表达及蛋白激酶B(AKT)磷酸化水平。结果与miR-21 NC比较，miR-21 inhibitor能显著抑制细胞活力[(0.728±0.045)vs.(0.393±0.018),P<0.01]，降低细胞克隆数目[(158.38±14.47)vs.(65.52±6.86),P<0.01]，提高细胞凋亡率[(8.45±0.67)%vs.(40.23±3.46)%,P<0.01]，并上调PTEN、PDCD4、Bax表达，下调Bcl-2表达及降低AKT磷酸化水平(P<0.01)。结论miR-21 inhibitor通过PTEN/AKT信号通路抑制人喉鳞癌Hep2细胞增殖和诱导凋亡，并调节细胞凋亡相关蛋白的表达。

miR-21；人喉鳞癌Hep2细胞；细胞增殖；细胞凋亡

喉鳞癌是我国耳鼻咽喉科常见的恶性肿瘤，占耳鼻咽喉科肿瘤的36%左右，其中喉鳞状细胞癌是其主要病理类型，占90%以上，手术治疗、化学疗法和放射治疗是其主要治疗方式，但对中晚期患者预后及5年生存率效果欠佳[1]。而喉鳞癌发病机制尚未清楚，吸烟、饮酒、病毒感染、环境污染、癌基因的激活及抑癌基因的失活都可能是其病因。miRNA是目前新发现的一类癌基因或抑癌基因，并与肿瘤的发生、发展密切相关，在肿瘤的增殖、凋亡、侵袭等生物学行为中起重要作用[2]。已通过miRNA芯片技术证实48对喉鳞状细胞癌标本中4个miRNA表达量显著上调，包括miR-21[3]。也发现喉鳞状细胞癌患者血清中miR-21表达量显著增高，并与淋巴结转移密切相关，并能作为喉鳞状细胞癌标记物及预后的独立因子[4]。提示miR-21在喉鳞癌中过表达，并作为癌基因参与喉鳞癌的发生、发展。本研究拟通过下调人喉鳞癌细胞中Hep2中miR-21的表达，探讨其对Hep2细胞增殖及凋亡的影响，从而为喉鳞癌的诊断及预后判断提供新的思路。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株人喉鳞癌细胞Hep2购于中国科学院细胞库，目录号：TCHu21。

1.1.2主要试剂和仪器兔抗Bax，Bcl-2单克隆抗体(Epitmics公司，美国)；兔抗PDCD4、PTEN、AKT、p-AKT单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司，美国)；miR-21 inhibitor及对照miR-21 NC(上海吉玛制药技术有限公司)；Hoechst 33258染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)法(Gibco公司，美国)；胎牛血清、DMEM培养基(Hyclone公司，美国)。迷你双垂直电泳仪、迷你转印电泳仪(北京六一仪器厂)；ChemiDocTMXRS凝胶成像系统(Bio-Rad公司，美国)。

1.2方法

1.2.1MTT法检测Hela细胞活力将人喉鳞癌细胞Hep2接种于96孔板，当细胞汇合度达到50%时，用LipofectamineTM2000分别转染miR-21 inhibitor和miR-21阴性对照(negative control,NC)。48 h后，加入5 mg/mL MTT 20 μL，继续培养4 h后吸弃培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μL，震荡使结晶物充分溶解，于酶标仪560 nm处测OD值，以OD值表示细胞相对活力。

1.2.2集落形成实验将人喉鳞癌细胞Hep2接种于96孔板，当细胞汇合度达到50%时，用LipofectamineTM2000分别转染miR-21 inhibitor和miR-21 NC，48 h后，用含10%甲醛和0.1%结晶紫染液固定染色。轻轻甩去染色液，拍照分析。

1.2.3Hoechst染色将人喉鳞癌细胞Hep2接种于6孔板，当细胞汇合度达到50%时，用LipofectamineTM2000分别转染miR-21 inhibitor和miR-21 NC。48 h后消化收集细胞，后按照Hoechst 33258染色试剂盒说明书进行操作，4%多聚甲醛固定，Hoechst 33258染色液避光染色，在荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.4Western blot将人喉鳞癌细胞Hep2接种于6孔板，当细胞汇合度达到50%时，用LipofectamineTM2000分别转染miR-21 inhibitor和miR-21 NC。48 h后消化收集细胞，加入RIPA裂解液裂解，离心即可获得总蛋白。根据BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定。蛋白上样，跑SDS凝胶电泳，后湿法转膜。一抗溶液孵育，4 ℃过夜；二抗溶液中室温孵育。在凝胶成像系统中曝光。用“Quantity one”软件对各抗体条带灰度值进行统计。

2　结　　果

2.1miR-21 inhibitor对人喉鳞癌细胞Hep2活力的影响人喉鳞癌细胞Hep2细胞转染miR-21 inhibitor和miR-21 NC 48 h后，经MTT实验发现miR-21 inhibitor能显著抑制细胞活力[(0.728±0.045)vs.(0.393±0.018)]，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2miR-21 inhibitor对人喉鳞癌细胞Hep2克隆形成及凋亡的影响miR-21 inhibitor能显著减少Hep2细胞克隆数目[(158.38±14.47)vs.(65.52±6.86)]，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。miR-21 inhibitor亦能显著提高Hep2细胞凋亡率[(8.45±0.67)%vs.(40.23±3.46)%]，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

A：miR-21 NC；B：miR-21 inhibitor。

图1miR-21 inhibitor对人喉鳞癌细胞Hep2克隆形成能力的影响

A：miR-21 NC；B：miR-21 inhibitor。

图2miR-21 inhibitor对人喉鳞癌细胞Hep2凋亡的影响

2.3miR-21 inhibitor对人喉鳞癌细胞Hep2中PDCD4、Bax及Bcl-2表达量的影响miR-21 inhibitor能显著上调PDCD4及Bax表达(P<0.01)，下调Bcl-2表达(P<0.01)，见图3、表1。

2.4miR-21 inhibitor对人喉鳞癌细胞Hep2中PTEN/AKT信号通路的影响miR-21 inhibitor能显著上调PTEN表达(P<0.01)，降低AKT磷酸化水平(P<0.01)，见图4、表2。

图3　　　　　miR-21 inhibitor对人喉鳞癌细胞Hep2中PDCD4、Bax及Bcl-2表达量的影响

项目Bcl-2BaxPDCD4miR-21NC1.143±0.0840.345±0.0731.296±0.089miR-21inhibitor0.367±0.027*1.012±0.025*0.379±0.063*

*：P<0.01，与miR-21 NC比较。

图4　　　　　miR-21 inhibitor对人喉鳞癌细胞Hep2中PTEN/AKT信号通路的影响

项目PTENp-AKT/AKTmiR-21NC0.354±0.0260.612±0.062miR-21inhibitor1.043±0.079*0.342±0.035*

*：P<0.01，与miR-21 NC比较。

3　讨　　论

miR-21是2001年Lagos-Quintana等在非脊椎动物和脊椎动物中首次发现的，随后在小鼠的神经元细胞及Hela细胞中陆续检测到，已证实miR-21与喉癌、大肠癌、卵巢癌、肺癌等多种肿瘤的发生、发展密切相关，其表达呈上调趋势[2,5]。Cao等[3]通过miRNA芯片分析也证实48例喉鳞状细胞癌标本中4个miRNA表达量显著上调，包括miR-21。Wang等[4]检测52例喉鳞状细胞癌患者及52例声带息肉患者血清中miR-21的表达，发现喉鳞状细胞癌患者血清中miR-21表达量显著增高，可作为喉鳞状细胞癌标记物及预后的独立因子。提示miR-21在喉鳞癌细胞中起致癌miRNA作用，并与喉鳞癌的发生、发展密切相关。此外，miR-21反寡义核苷酸既能在体外显著抑制宫颈癌SiHa细胞增殖，诱导细胞凋亡，并能在体内抑制SiHa细胞裸鼠移植瘤生长，促进其凋亡[6-7]。miR-21 inhibitor亦对胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、舌鳞状细胞癌细胞具有增殖抑制及凋亡诱导作用[8-10]。说明下调miR-21表达能显著地影响多种肿瘤细胞的增殖与凋亡，同时已报道PTEN、PDCD4、Bcl-2等多个蛋白是miR-21在不同肿瘤细胞中的靶基因，通过靶向调节靶基因表达，影响肿瘤细胞的增殖凋亡等行为[11]。所以本研究在此基础上，探讨miR-21是否通过调节相关靶蛋白的表达，从而影响喉鳞癌细胞Hep2的增殖与凋亡。

细胞的凋亡受细胞凋亡基因严格调控，其中研究最为广泛的是Bcl-2家族，Bcl-2可显著促进癌细胞的生长增殖并阻滞癌细胞凋亡，在喉鳞癌组织呈高表达[12]。Bax是Bcl-2家族成员，与Bcl-2形成二聚体，维持细胞增殖凋亡平衡，Bax在喉鳞癌组织中低表达，并参与喉癌细胞凋亡的调控[13]。PDCD4是新近发现的抑癌基因，可通过诱导肿瘤细胞凋亡或阻滞细胞周期，从而抑制肿瘤细胞的生长，其在人乳腺癌、肺癌、肠癌、喉癌等肿瘤中低表达，甚至缺失，与肿瘤的发生、发展密切相关[14-16]。因此上调Bax及PDCD4表达，下调Bcl-2表达，能有效地促进喉癌细胞凋亡，从而抑制癌细胞增殖。本研究结果表明，miR-21 inhibitor能显著抑制Hep2细胞克隆，诱导细胞凋亡，下调Bcl-2的表达，上调Bax及PDCD4的表达。

肿瘤的增殖与凋亡受众多信号通路调控，PI3K/AKT信号通路就是其中一种，其具有抗凋亡通路之称，能与多种人类肿瘤的发生、发展密切相关，能通过下游多种靶蛋白表达，如Bcl-2、PDCD4等，参与调控肿瘤细胞生长、凋亡、血管生成及侵袭等过程。PI3K/AKT上游蛋白PTEN是miR-21的下游靶基因，在众多肿瘤中表达低下，缺失或突变。PTEN能将三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化为二磷酸脂酰肌醇(PIP2)，从而负调控PI3K/AKT信号通路，在细胞凋亡中起重要作用。已报道PI3K/AKT在喉鳞癌中异常激活[17]。下调miR-21的表达可通过PTEN/AKT信号通路抑制白血病K562细胞增殖及迁移[18]。推测miR-21也能通过PTEN/PI3K/AKT信号通路影响喉癌细胞增殖凋亡等生物学行为。因此，本研究通过Western blot检测miR-21转染后，细胞中此信号通路蛋白的表达情况，结果表明，miR-21 inhibitor能显著上调PTEN表达，降低AKT磷酸化水平，从而提示miR-21表达量下调后能通过PTEN/AKT信号通路抑制喉鳞癌细胞Hep2增殖并诱导细胞凋亡。

综上所述，miR-21 inhibitor能显著的诱导喉鳞癌细胞Hep2凋亡，并抑制其克隆形成，与下调Bcl-2表达、上调Bax及PDCD4表达有关，可能是通过PTEN/AKT信号通路实现。

[1]Zhang W,Liu Y,Wang CW.S100A4 promotes squamous cell laryngeal cancer Hep-2 cell invasion via NF-kB/MMP-9 signal[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014,18(9):1361-1367.

[2]张经波，汪荣泉．mir-21的转录调控及在肿瘤中的作用研究进展[J]．重庆医学，2012，41(31)：3336-3337,3346．

[3]Cao PY,Zhou L,Zhang J,et al.Comprehensive expression profiling of microRNAs in laryngeal squamous cell carcinoma[J].Head and Neck-Journal for the Sciences and Specialties of the Head and Neck,2013,35(5):720-728.

[4]Wang JT,Zhou YD,Lu J,et al.Combined detection of serum exosomal miR-21 and HOTAIR as diagnostic and prognostic biomarkers for laryngeal squamous cell carcinoma[J].Medical Oncology,2014,31(9):148.

[5]Ludvikova M,Kalfert D,Pesta M,et al.MicroRNA profile in site-specific head and neck squamous cell cancer[J].Virchows Archiv,2014,465(1):321.

[6]Huang Y,He Y,Li J.MicroRNA-21:a central regulator of fibrotic diseases via various targets[J].Curr Pharm Des,2015,21(17):2236-2242.

[7]王晓玫，许静，成志强，等．微小RNA-21反义寡核苷酸对宫颈鳞癌SiHa细胞株细胞生物学特性影响的体内外实验研究[J]．中华病理学杂志，2012，41(4)：254-259．

[8]Zhu W,Xu B.MicroRNA-21 identified as predictor of cancer outcome:a meta-analysis[J].PLoS One,2014,9(8):e103373.

[9]Wang Y,Zhu Y,Lv P,et al.Targeting miR-21 with AS-miR-21 suppresses aggressive growth of human tongue squamous cell carcinoma in vivo[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(5):4773-4781.

[10]齐志勇，贾永峰，张治平，等．S100A4、Bcl-2、Survivin在喉癌组织中的表达及临床意义[J]．现代中西医结合杂志，2014，23(9)：929-932,969．

[11]蔡雯，崔颖，张婷婷，等．Survivin、Bax蛋白在喉病变组织中的表达及临床意义[J]．重庆医学，2011，40(20)：1988-1990,1994．

[12]Lankat-Buttgereit B,Göke R.The tumour suppressor Pdcd4:recent advances in the elucidation of function and regulation[J].Biol Cell,2009,101(6):309-317.

[13]冯国飞，李培华，尤慧华，等．喉癌组织中程序性细胞死亡因子4的表达及临床意义[J]．临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2011，25(1)：16-19．

[14]Yao Q,Xu H,Zhang QQ,et al.MicroRNA-21 promotes cell proliferation and down-regulates the expression of programmed cell death 4 (PDCD4) in HeLa cervical carcinoma cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,388(3):539-542.

[15]Asangani IA,Rasheed SA,Nikolova DA,et al.MicroRNA-21 (miR-21) post-transcriptionally downregulates tumor suppressor Pdcd4 and stimulates invasion,intravasation and metastasis in colorectal cancer[J].Oncogene,2008,27(15):2128-2136.

[16]Chen Y,Liu W,Chao T,et al.MicroRNA-21 down-regulates the expression of tumor suppressor PDCD4 in human glioblastoma cell T98G[J].Cancer Lett,2008,272(2):197-205.

[17]杨大志，姬长友．PI3K、p-Akt蛋白在喉鳞癌中的表达及临床意义[J]．第三军医大学学报，2007，29(10)：935-937．

[18]吴共发，黄绮亭，曾宇婷，等．miR-21通过PTEN/AKT通路抑制白血病细胞K562的迁移和增殖[J]．医学研究生学报，2013，26(10)：1037-1040．

·经验交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.034

曲莉(1980-)，硕士，主治医生，主要从事耳鼻喉疾病的研究。

R739.65

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1671-8348(2016)24-3411-03

2016-03-04

2016-05-24)