食品来源副溶血性弧菌毒力基因分布及分子分型研究

陈 晶，黄建飞，刘丛丛，刘灵燕，赖小红，杨国武，兰全学（深圳市计量质量检测研究院食品检测所，广东深圳518131）

食品来源副溶血性弧菌毒力基因分布及分子分型研究

陈 晶，黄建飞，刘丛丛，刘灵燕，赖小红，杨国武，兰全学*
（深圳市计量质量检测研究院食品检测所，广东深圳518131）

分析食品中分离获得的副溶血性弧菌主要毒力基因的分布特征、血清型及分子分型特点，为食源性副溶血性弧菌感染暴发的早期预警和疫情溯源提供实验室数据。提取40株副溶血性弧菌基因组，分别用PCR检测VcrD1、Vp1680、VopP和VcrD2基因，荧光PCR检测tdh、trh和tlh基因。对40株菌株进行血清型分型并采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对其进行分子分型。利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析，建立PFGE分子分型数据库。40株菌株均未检测到tdh、trh、VopP和VcrD2基因，tlh、VcrD1和Vp1680基因阳性检测率为100%。40株菌株中含有16种血清型，其中9株未分型，主要血清型为O2∶K28和O5∶K17，血清型分布呈多样性。40株菌株共获得39个不同的PFGE带型，PFGE呈现遗传多样性，无优势带型。本实验食品环境中分离的副溶血性弧菌未发现毒力因子，副溶血性弧菌血清型呈分散趋势且菌株之间亲缘关系较远。

副溶血性弧菌，脉冲场凝胶电泳，血清分型，毒力基因

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一种革兰氏阴性嗜盐菌，Fujino等［1］于1953年从食物中毒患者体内首次分离，它广泛分布于近海区域、鱼、贝类等海产品以及腌制食品中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌，可以导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐和头疼等典型胃肠炎反应，严重者可以引起败血症［2］。国家食源性疾病监测网数据显示，副溶血性弧菌引起的食物中毒在发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，已经高居微生物性食物中毒之首。与该菌的致病相关的溶血素因子包括耐热直接溶血素（tdh）、耐热直接相关溶血素（trh）、不耐热溶血素（tlh）。tdh和trh具有溶血活性、肠毒活性、细胞毒性和心脏毒性等生物学活性；tlh是一种非典型的磷脂酶，在卵磷脂存在的条件下具有溶血活性，主要分泌于细胞外［3］。

2002年Tagomori［4］在副溶血性弧菌基因组分析中发现三型分泌系统（T3SS）。T3SS由位于染色体1和2上的T3SS1及TSSS2两个基因簇组成，与细菌对机体的细胞毒性和肠毒性有关，T3SS1分泌具有细胞毒性的效应蛋白Vp1680和编码内膜蛋白VcrD1，T3SS2分泌具有肠毒性的效应蛋白VopP和编码内膜蛋白VcrD2［5-7］。Okada等［8］研究表明T3SS2跟副溶血性弧菌致病性有关。目前国内主要研究副溶血性弧菌毒力因子tdh、trh、tlh、ToxR、UreC和ORF8，研究的菌株主要来源临床和海产品环境，三型分泌系统的毒力基因Vp1680和VopP研究较少。

本文对不同食品来源分离获得的副溶血性弧菌进行tdh、trh、tlh、VopP、VcrD2、VcrD1、Vp1680毒力基因检测、血清型分型和脉冲场凝胶电泳技术分子分型研究，分析不同来源菌株的相关性，了解副溶血弧菌的毒力因子分布特点，为构建副溶血性弧菌的基因指纹图谱库和分子溯源平台提供有效的实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

40株副溶血性弧菌 从深圳各大农贸市场、超市、酒店等食品样品中分离所得，均经GB/T 4789.7-2008《食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》标准方法检测确认为副溶血性弧菌；副溶血性弧菌参照株Vp08415（tdh+，trh+） 为深圳市疾控中心馈赠，以上所有的菌株用3%氯化钠碱性蛋白胨水37℃振荡培养18 h；ExTaq聚合酶、qPCR聚合酶、DNA Marker和基因组提取试剂盒 Takara；副溶血性孤菌诊断血清 日本生研株式会社公司；实验中所用引物见表1。

Agilent Mx3005P荧光PCR仪 Agilent公司；PCR仪和PFGE电泳仪CHEF DR-Ⅱ BIO-RAD公司。

1.2 毒力基因检测

试剂盒提取40株副溶血性弧菌基因组，以此为模板参照Tsai等［9］PCR体系扩增VcrD1、Vp1680、VopP 和VcrD2基因。tdh、trh和tlh检测参照Ward等［10］荧光PCR反应体系，其中tdh和trh采用双重荧光PCR。

1.3 血清学分型

参照诊断血清说明书，K抗原直接用3%NaCl溶液制成的菌悬液进行玻片凝集实验，3%NaCl溶液作为对照。将菌体用含3%NaCl的5%甘油溶液制成菌悬液，121℃灭菌1 h，用生理盐水洗涤3次并制成菌悬液进行O抗原凝集实验，生理盐水作为自凝对照。

1.4 PFGE分型

参照美国疾病控制中心（CDC）使用的霍乱弧菌脉冲场电泳标准方法［11］，对40株副溶血弧菌进行PFGE分型。分别用NotI和XbaI限制性内切酶酶切副溶血性弧菌胶块和参考菌株沙门氏菌H9812胶块。电泳参数分为两部分：电压6.0 V，转换角度120℃，起始转换时间2 s，最终转化时间10 s，电泳13 h；电压6.0 V，转换角度120℃，起始转换时间20 s，最终转化时间25 s，电泳6 h，利用Bio Numerics软件分析PFGE电泳图谱。

2 结果与分析

2.1 VopP、VcrD2、VcrD1、Vp1680基因检测结果

VcrD1和Vp1680基因扩增产物经1.5%琼脂糖电泳检测均含有目的条带，跟预期条带500 bp相符合（见图1和图2），VopP和VcrD2都未检测到目的条带。

2.2 tdh、trh和tlh荧光结果

40株副溶血性弧菌均未检测到tdh、trh基因，tlh阳性率为100%，结果见图3。实验数据与陈茂义等［12］对水产品和环境中分离的81株副溶血性弧菌结果相同。

2.3 血清型分布

40株副溶血性弧菌共鉴定出16种血清型（O抗原有8种分型，K抗原有16种分型），其中9株为不可分型。主要血清型为O2∶K28、O5∶K17、O1∶K32、O3∶K43、O4∶K34，所占比例分别为15%、12.5%、7.5%、7.5%、7.5%，其他血清型各1株，包括O6∶K46、O3∶K5、O1∶K32、O3∶K30、O1∶KUT、O5∶KUT等，血清型多样化，呈分散趋势。其中O1∶KUT、O5∶KUT是1996年后引起多起暴发的主要血清型，该血清型菌株和O3∶K6共同参与组成“大流行菌群”［13］。

表1 实验中常用引物Table1 Primers used in this study

图1 VcrD1片段凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of VcrD1 fragements

图2 Vp1680片段凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of Vp1680 fragements

2.4 PFGE分析

Wagley S等［14］实验研究证实副溶血性弧菌环境分离株与临床分离株存在相同的克隆型。因此，运用PFGE方法对各种来源的菌株进行分子分型具有现实意义。通过PFGE分析，40株副溶血性弧菌得到39种带型，各菌株DNA条带为12～20条，条带分子量最大为1221 kb，最小为18.84 kb，无优势带型，呈现遗传多样性（见图4）。经类聚分析，菌株间相似性集中在30%～60%之间。同一血清型菌株的PFGE图谱之间存在至少有7条带以上差异，如6株O2∶K28和5株O5∶K17，为不相关菌株。在30%相似水平上可分为4（A1～A4）个群，其中A3群含有29株，占72.5%，17株菌来自海产品（14株来自海水鱼，2株来自虾，1株来自贝类），1株来自淡水鱼，7株来自猪肉和鸡肉，4株来自凉菜。A1含有8株，占20%，其中有2株PFGE带型完全相同，分别来自鲜榨胡萝卜汁和鸡肉，表明其受同一克隆菌株的污染。

图3 tdh、trh和tlh荧光PCRFig.3 Real-time fluorescent PCR of tdh，trh and tlh

图4 PFGE分型聚类树状图Fig.4 PFGE patterns of vibrio parahaemlyticus isolates

3 结论

毒力基因tdh、trh、VopP和VcrD2结果为阴性，tlh、vcrD1和VP1680基因检出率100%。tlh和T3SS1在临床分离株和环境分离株中均存在，具有菌种特异性。副溶血性弧菌来源多样，20株来源于海产品（18株来自海鱼，1株来自生蚝，1株来自冻虾），1株来自淡水鱼，11株来自鸡肉和猪肉，7株来自即食菜肴，1株来自榨果汁，显示交叉污染严重，应引起重视。菌株血清型与食品种类无相关性，血清型分布和PFGE分子分型均呈现多样性，菌株之间亲缘关系较远。

Ottaviani等［15］发现4株不携带tdh、trh基因和T3SS2系统的副溶血性弧菌也能够引起急性胃肠炎，提示存在其他未知致病因子。因此，加大监督力度，做好食品安全风险预警是必要的，以有效控制相关食品中该菌的污染和食物中毒的发生。

［1］Fujino T，Okuno Y，Nakada D，et al.On the bacteriological examination of shirasu food poisoning［J］.Med J Osaka Univ，1953，4：299-304.

［2］高磊，邓益琴，刘助红，等.石斑鱼及暂养环境中副溶血弧菌分离鉴定与毒力评价［J］.海洋与湖沼，2014，45（6）：1281-1287.

［3］Theethakaew C，Feil E J，Castillo-Ramirez S，et al.Genetic relationships of vibrio parahaemolyticus isolates from clinical，human carrier，and environmental sources in Thailand，determined by multilocus sequence analysis［J］.Applied and Environmental Microbiology，2013.

［4］Tagomori K，Iida T，Honda T.Comparison of genome structures of Vibrio，bacteria possessing two chromosome［J］.Journal of Bacteriology，2002，184（16）：4351-4358.

［5］Makino K，Oshima K，Kurokawa K，et al.Genome Sequence of Vibrio parahaemolyticus：a pathogenic mechanism distinct from that of V cholerae［J］.The Lancet，2003，361（9359）：743-749.

［6］Ono T，Park K S，Ueta M，et al.Identification of proteins secreted via vibrio parahaemolytics type Ш secreted system1［J］.Infection and Immunity，2006，74（2）：1032-1042.

［7］Park K S，Ono T，Rokuda M，et al.Functional characterization of two type III secretion systems of Vibrio parahaemolyticus［J］.Infection and Immunity，2004，72（11）：6659-6665.

［8］Okada N，Lida T，Park K S，et al.Indentification and characterization of a novel type Ш secretion system in trhpositive Vibrio parahaemolyticus strain TH3996 reveal genetic lineage and diversity of pathogenic machinery beyond the species level［J］.Infection and Immunity，2009，77（2）：904-913.

［9］Ward L N，Bej A K.Detection of Vibrio parahaemolyticus in Shellfish by Use of Multiplexed Real-Time PCR with TaqMan Fluorescent Probes［J］.Applied and Environmental Microbiology，2006，72（3）：2031-2042.

［10］Tsai S，Jong K J，Tey Y H，et al.Molecular characterization of clinical and environmental Vibrio parahaemolyticus isolates in Taiwan［J］.International Journal of Food Microbiology，2013，165 （1）：18-26.

［11］Cooper K L F，Luey C K L，Bird M，et al.Development and Validation ofa PulseNetStandardized Pulsed-Field Gel Electrophoresis Protocol for Subtyping of Vibrio cholerae［J］.Foodborne Pathogens and Disease，2006，3（1）：51-58.

［12］陈茂义，胡婕，陈婷，等.荆州市不同来源副溶血性弧菌毒力基因分布及分子分型研究［J］.中国卫生检验杂志，2014，24 （2）：231-235.

［13］韩海红，李宁，郭云昌.副溶血性弧菌分子标志基因研究概况［J］.微生物学报，2015，55（1）：12-21.

［14］Wagley S，Koofhethile K，Wing B，et al.Comparison of V.parahaemolyticus isolated from seafoods and cases of gastro in testinal disease in the UK ［J］.International Journal of Environmental Health Research.2008，18（4）：283-293.

［15］Ottaviani D，Leoni F，Serracca L，et al.Nontoxigenic Vibrio parahaemolyticus Strains Causing Acute Gastroenteritis［J］.Journal of Clinical Microbiology，2012，50（12）：4141-4143.

Study on virulence genes distribution and molecular subtyping of Vibrio parahaemolyticus from different food resources

CHEN Jing，HUANG Jian-fei，LIU Cong-cong，LIU Ling-yan，LAI Xiao-hong，YANG Guo-wu，LAN Quan-xue*
（Food Testing Institute，Shenzhen Academy of Metrology&Quality Inspection，Shenzhen 518131，China）

The distribution of virulence genes、serogroup and molecular subtyping of Vibrio parahaemlyticus isolated from different resources of food were analysed，which contribute to provide scientific evidence for surveillance and source tracking.Forty strains of Vibrio parahaemolyticus genomes were extracted，VcrD1，Vp1680，VopP，VcrD2 were amplified by PCR and tdh，trh，tlh genes were detected by Real-time fluorescent PCR.All of strains were subtyped by pulsed-field gel electrophoresis and serotyped.PFGE patterns were clustered by Bionumerics software.Virulence genes tdh，trh，VopP and VcrD2 were not detected，genes of tlh，VcrD1 and Vp1680 were all positive detected.Sixteen serotypes were observed，the serotyping of 9 isolates failed.The major were O2∶K28and O5∶K17.No predominant serotype was detected.Thirty-nine PFGE patterns were detected and no predominant pattern.No virulence genes were detected.The isolates from food resource showed diversified serotype feature and far genetic distance.

Vibrio parahaemlyticus；PFGE；serogroup；virulence genes

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0239-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.041

2015－07－21

陈晶（1976-），女，硕士，工程师，研究方向：食品微生物检测，E-mail：59420435@qq.com。

兰全学（1977-），男，硕士，高级工程师，研究方向：食品微生物检测，E-mail：61723585@qq.com。