衡水老白干酒中产酸微生物的分离鉴定及性能研究

孙鹏飞，张福艳，吴海静，朱文众*

（1.河北科技大学 生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北衡水老白干酿酒集团，河北 衡水 053000）

衡水老白干酒中产酸微生物的分离鉴定及性能研究

孙鹏飞1，张福艳2，吴海静1，朱文众1*

（1.河北科技大学 生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北衡水老白干酿酒集团，河北 衡水 053000）

有机酸是白酒的重要呈味物质，也是香味成分的前驱物质。利用气相色谱和高效液相色谱检测出衡水老白干酒中含有乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和乳酸等6种有机酸。经试验在大曲、酒醅中分离得到69株产酸菌，其中具有代表性的醋酸菌1株，乳酸菌4株，丙酸菌2株。对其中一株主要产酸菌进行了16S rDNA鉴定为食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria），并对其的产酸特性进行初步研究，结果表明，在初始pH值6.5，接种量7%，温度32℃，培养36 h时乳酸产量最高，为7.12 mg/mL。

有机酸；产酸菌；分离鉴定；产酸性能

白酒的化学成分中98%～99%是水和乙醇，1%～2%是呈香呈味的微量组分［1-2］。微量组分主要包括有机酸、酯、醇、醛等［3］，由于它们在白酒中的种类和含量的不同，就形成了不同风格、不同香型、不同质量的白酒［4-5］。

有机酸是白酒的重要呈味物质，也是白酒香味成分的前驱物质［6-7］，因此没有酸就形不成酯。适量的酸能对白酒起到缓冲作用，能使酒体丰满、协调、回味悠长，在贮存过程中也可以形成酯［8-9］。白酒中的有机酸主要来自微生物代谢［10-11］。由于采用多菌种开放式发酵，代谢产生的有机酸具有多样性［12］，且不同类型白酒中有机酸的含量也不相同［13-14］。

衡水老白干酒中的乳酸和乙酸的含量远远高于其他酸类［15］，是衡水老白干酒具有的特征之一。衡水老白干酒酿酒大曲中的产酸菌主要来源于周围环境、水和原料，并且酿酒过程中采用开放式发酵方式，因此就形成了与当地环境、水源相关的独特产酸菌群，从而决定了衡水老白干酒中有机酸的含量以及比例与其他香型的不同，形成了老白干酒特有的风格。

因此，本研究对老白干香型的代表衡水老白干酒中有机酸进行了检测，对大曲、酒醅中的产酸菌进行了分离鉴定，并对主要产酸菌进行了初步产酸特性研究。期望对衡水老白干酒生产中有机酸的利用以及产酸菌的应用控制提供依据，并为进一步研究有机酸对衡水老白干酒风味的影响有所帮助。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1样品来源

大曲、发酵终点时期的酒醅由衡水老白干酿酒（集团）有限公司提供。

1.1.2主要试剂

乳酸、乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、异戊酸、正己酸、辛酸（均为分析纯）：天津市复光精细化工研究所。

1.1.3培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，NaCl 3 g，制霉素55 μg/mL。去离子水1 L，pH值调至7.0。

MRS培养基：酵母提取物5 g，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，K2HPO41.5 g，柠檬酸二铵1.5 g，乙酸钠2 g，吐温-80 2 mL，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·4H2O 0.2 g，去离子水1 L，pH值调至6.2～6.4。

醋酸菌液体培养基：葡萄糖1 g，酵母膏1 g，3%无水乙醇，去离子水100 mL。pH值调至7.0。

醋酸菌固体培养基：在醋酸菌液体培养基中加入几滴溴甲酚紫指示剂并加入1.8%的琼脂，制平板。

1.2仪器与设备

Agilent 6820气相色谱仪、Agilent 1260高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；LRH-150B生化培养箱：广东省医疗器械厂。

1.3实验方法

1.3.1衡水老干酒中有机酸的定性定量分析

通过气相色谱直接进样法对衡水老白干酒中的有机酸进行定性分析。气相色谱条件：氢火焰离子检测器，19091N-236 INNOWAX毛细管柱（0.25 mm×60 m），载气（N2）流速为120 mL/min，干燥空气流速为400 mL/min，氢气流速为20 mL/min。柱温采用程序升温：70℃维持2 min，以4℃/min升温至250℃维持5 min。进样口温度为250℃，进样量1 μL。

实验中发现气相色谱不能很好地利用直接进样法测定酒中的乳酸，因此另用高效液相色谱对衡水老白干酒中的主要有机酸进行定量测定。高效液相色谱条件：紫外检测器，选用Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱（300 mm× 7.8 mm），以5 mmol硫酸为流动相，流速为0.5 mL/min，检测波长210 nm，柱温50℃，进样量20 μL。

1.3.2产酸菌的富集、分离

取大曲、酒醅各5 g分别加入95 mL无菌生理盐水中浸泡30 min，振荡均匀取上清液5 mL加入已灭菌并装有95 mL液体培养基的三角瓶中，于37℃恒温培养36 h。连续富集2次。

将富集培养液进行梯度稀释，涂布于固体培养基上，以好氧和厌氧2种方式在37℃条件下恒温培养，将由紫变黄变色圈的单菌落挑出，通过平板划线分离法纯化。

1.3.3产酸菌的鉴定

（1）产酸菌菌落形态鉴定

将分离到的产酸菌接种到固体培养基上于37℃培养36 h观察菌落特征，挑取单菌落进行革兰氏染色，并观察产酸菌的菌体形态。

（2）产酸菌的生理生化试验鉴定

依据《伯杰氏鉴定细菌学手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对分离到的产酸菌进行过氧化氢酶测定、明胶液化试验、葡萄糖产酸产气等生理生化试验。

（3）产酸菌的发酵产酸测定

将纯种产酸菌接种到液体培养基中发酵48 h。取发酵液5 mL在离心机上4 000 r/min离心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤。用高效液相色谱仪对产酸菌所产酸进行检测。

（4）主要产酸菌的16S rDNA鉴定

将主要产酸菌在平板上培养24 h，选取菌落生长较好的平板，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。将得到的基因组作为模板进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR正向引物16SF1：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，反向引物16SR1：AGAAAGGAGGTGATCCAGCC。

PCR扩增反应条件为：95℃预变性4 min；94℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸90 s，32个循环；72℃延伸10 min。

PCR扩增产物委托苏州金唯智生物科技有限公司完成测序。并将测序得到的16S rDNA序列通过NCBI网站中的GenBank数据库进行Blast比对，利用MEGA 5.0软件构建系统发育树。

1.3.4主要产酸菌产酸性能研究

分别以不同的温度、pH值、接种量为条件，将主要产酸菌接种到液体培养基中培养36h，高效液相色谱测定产酸量。

2　结果与分析

2.1衡水老白干酒中有机酸定性定量检测

通过气相色谱对有机酸标准品的检测，不同有机酸标准品及衡水老白干酒样气相色谱图见图1，保留时间见表1。

图1　有机酸标准品（A）及衡水老白干酒样（B）气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of organic acids standards（A）and Hengshui LaobaiganBaijiusample（B）

表1　气相色谱检测不同有机酸保留时间Table 1 Retention time of different organic acids analysis by GC

通过对比表1的保留时间，可以判断在气相色谱中检测出乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和异戊酸5种有机酸。

由于气相色谱不能很好的利用直接进样法测定酒中的乳酸，并且在测定过程中发现乙酸的重现也不好。因此另用高效液相色谱对衡水老白干酒中的主要有机酸进行定量分析。衡水老白干酒样相色谱图见图2，各有机酸保留时间、回归线方程和相关系数见表2。

图2　衡水老白干酒样高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of Hengshui LaobaiganBaijiusample

表2　高效液相色谱检测不同有机酸保留时间、回归线方程和相关系数Table 2 Retention times，regression equation and the correlation coefficient of different organic acids analysis by HPLC

由图2及表2可知，高效液相色谱法检测出了衡水老白干酒样中乳酸、乙酸、丙酸3种有机酸，通过回归线方程计算得乳酸、乙酸和丙酸的含量分别为110.34 mg/100 mL，38.03mg/100mL，1.64 mg/100 mL。由此可知，衡水老白干酒中乳酸含量较高，为主要有机酸。

2.2产酸菌分离

共分离出69株产酸菌，编号为1#～69#。其中：在牛肉膏蛋白胨培养基上分离得到40株；MRS固体培养基上分离得到16株；醋酸菌培养基上分离得到13株。

2.3产酸菌鉴定

2.3.1产酸菌的菌落形态特征

根据菌落的形态特征和革兰氏染色对菌体形态的显微镜观察，至少筛选出7种不同形态的菌株，镜检结果如表3。其中3#、4#、5#3株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上分离，26#、28#、36#3株在MRS固体培养基上分离，1#在醋酸菌培养基上分离。

表3　产酸菌的菌落形态及镜检结果Table 3 Colony morphology and microscopic results of acid-producing bacteria

由表3的结果分析可知，7株产酸菌都符合细菌的形态特征，1#、4#菌革兰氏染色为阴性，其他菌革兰氏染色为阳性；3#、28#菌为球菌，其他为杆菌。

2.3.2产酸菌的生理生化试验鉴定

对7株产酸菌进行生理生化试验，结果见表4。

表4　产酸菌的生理生化试验结果Table 4 Results of physiological biochemical tests of acid-producing bacteria

由表4的结果分析可知，1#菌过氧化氢酶阳性，产酸，革兰氏染色阴性，好氧，符合醋酸菌的特征；4#菌过氧化氢酶阳性，明胶液化阳性，产酸，革兰氏染色阴性，厌氧，产生大量气体，符合丙酸菌特征；3#，26#，28#，36#菌过氧化氢酶阴性，产酸，革兰氏染色阳性，厌氧，不产生气体，无运动性，符合乳酸菌特征；5#菌革兰氏染色阳性，产酸，厌氧，但有运动性，符合丙酸菌特征。

2.3.3产酸菌的发酵产物测定

以7%的接种量将纯种产酸菌接入到液体培养基中，32℃恒温发酵48 h。通过高效液相色谱对发酵液进行检测，检测结果为1#菌产生乙酸；3#、26#、28#、36#菌产生乳酸并产生少量乙酸；4#、5#菌产生丙酸和乙酸。其中26#菌产乳酸量最大，产酸量为7.08 mg/mL；1#菌产乙酸量最大，产酸量为2.26 mg/mL；4#菌产丙酸量最大，产酸量为0.45 mg/mL。由发酵液的高效液相色谱检测结果，可以进一步确定1#菌为醋酸菌；3#、26#、28#、36#菌为乳酸菌；4#、5#菌为丙酸菌。

2.3.4主要产酸菌的16S rDNA鉴定

选择产乳酸量最高的26号菌株进行16S rDNA序列鉴定。用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，将得到的基因组作为模板进行PCR扩增。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。由图3可知，PCR扩增产物凝胶电泳条带单一长度大约为1 500 bp。

图3　26#菌株16S rDNA的PCR扩增凝胶电泳图Fig.3 Gel electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplified of strain 26#

16S rDNA扩增产物委托苏州金唯智生物科技有限公司完成测序，结果得到1 106个碱基。将16S rDNA序列测定结果提交到GenBank数据库中，进行Blast同源性比对，利用MEGA 5.0软件构建系统发育树，结果见图4。由图4可知，26#菌株与食窦魏斯氏菌M.D.W.YAN2-10相似性为99%，在系统发育树中同源关系近。因此可以鉴定26#乳酸菌为食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）。

图4　26#菌株16S rDNA的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rDNA of strain 26#

2.5产酸菌产酸特性的研究

衡水老干白酒的主要有机酸成分为乳酸，选产酸量最高的26#菌食窦魏斯氏菌进行产酸特性研究。

2.5.1产酸菌的生长曲线

图5　产酸菌株26#的生长曲线Fig.5 The growth curve of acid-producing strain 26#

以3%接种量接入液体培养基中，在37℃下静置培养，每隔4 h取样，在600 nm波长条件下测定OD600nm值，同时测定乳酸生成量、pH值，结果见图5。

由图5可知，该菌开始生长缓慢，在4 h后进入对数期，随着菌体的迅速生长，产酸量迅速增加，pH值也迅速降低，在14 h后生长基本进入稳定期，pH值也趋于稳定，产酸量在24 h后基本不再变化。最终pH值保持在3.6左右，产酸量达到4.86 mg/mL。

2.5.2接种量对产酸量的影响

分别以1%、3%、5%、7%、9%的接种量接种于MRS液体培养基，在37℃下恒温培养36 h。对不同的接种量的产酸情况进行分析，结果见表5。

由表5可知，随着接种量增加，产酸量先上升后下降，接种量在5%～7%时产酸量较大，在7%产酸量最大，乳酸含量为5.31 mg/mL。当接种量＞7%时，可能因为培养基更多用于菌体生长，减少了酸的生成。因此最适接种量为7%。

表5　接种量对乳酸产量的影响Table 5 Effect of inoculum on lactic acid yield

2.5.3初始pH值对产酸量的影响

用氢氧化钠、盐酸调节MRS液体培养基初始pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，以3%的接种量，在37℃下恒温培养36 h。对产酸量进行测定，结果见表6。

表6　初始pH值对乳酸产量的影响Table 6 Effect of initial pH on the lactic acid yield

由表6可知，初始pH值为6.5～7.0时产酸量较高，初始pH值为6.5时乳酸含量最高达到5.32 mg/mL。初始pH值≤6.0时产酸明显减少，说明在酸性环境下对酸的生成有明显抑制作用。因此最适初始pH值为6.5。

2.5.4温度对产酸量的影响

以3%的接种量接种于MRS液体培养基中，分别置于22℃、27℃、32℃、37℃、42℃下恒温培养36 h。对产酸菌在不同的温度下培养的产酸量情况进行分析，结果见表7。

表7　温度对乳酸产量的影响Table 7 Effect of temperature on the lactic acid yield

由表7可知，在32～37℃时产酸量较高。温度对产酸量具有明显的影响，随着温度的升高产酸量先明显升高，在32℃时乳酸含量达到最高，为5.10 mg/mL，37℃以上时随温度升高产酸量明显下降。因此最适温度为32℃。

2.626#菌株产酸特性验证实验

在初始pH值为6.5，接种量7%，温度32℃条件下，对26#菌株产酸量进行3次验证实验，结果表明，乳酸产量最高为7.12 mg/mL。

3　结论

检测出衡水老白干酒中含有乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和乳酸等6种有机酸，并对主要的有机酸进行了定量分析，乳酸含量为110.34 mg/100 mL，乙酸含量为38. 03 mg/100 mL，丙酸含量为1.64 mg/100 mL，其中乳酸含量较高，为主要有机酸。

从大曲、酒醅中分离纯化得到69株产酸菌，其中具有代表性的醋酸菌1株，乳酸菌4株，丙酸菌2株。其中26#菌产乳酸量最大，1#菌产乙酸量最大，4#菌产丙酸量最大，产酸量分别为7.08 mg/mL，2.26 mg/mL，0.45 mg/mL。

对产酸量最高26#菌进行16S rDNA鉴定，为食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）。并对产酸特性进行了初步研究，在初始pH值为6.5，接种量7%，温度32℃时该菌乳酸产量最高，为7.12 mg/mL。

［1］沈怡方.白酒生产技术全书［M］.北京：中国轻工业出版社，2015.

［2］邵燕，张宿义，祝成，等.浓香型白酒风味物质与感官评定相关性研究［J］.中国酿造，2012，31（8）：92-95.

［3］陈涛，徐燕.浅谈白酒中微量成分的分析研究［J］.中国科技信息，2011（8）：51.

［4］刘殿英.酸在清香型白酒质量中的关系及其工艺控制［J］.技术与市场，2008（8）：66-67.

［5］李付丽，吴鑫颖，王晓丹，等.微生物技术在浓香型白酒增香方面的应用［J］.中国酿造，2014，33（1）：9-13.

［6］陶锐.浅析白酒酒体设计中对酸的认识［J］.酿酒，2010，37（5）：50-52.

［7］陶新功，孙国昌，朱瑞康，等.从四大酯类含量分析糟烧白酒［J］.中国酿造，2013，32（9）：120-122.

［8］陶景兰.酸味对白酒的益与害及预防措施的探讨［J］.山西食品工业，2002（1）：30-31.

［9］刘晓辉，郝引璋.浅谈新型白酒中酸含量对酒质的影响［J］.酿酒，2001，28（3）：39.

［10］张中义，畅晓霞.有机酸对大曲酒品质影响分析［J］.酿酒，2009，36（5）：37-39.

［11］程伟，吴丽华，徐亚磊，等.浓香型白酒酿造微生物研究进展［J］.中国酿造，2014，33（3）：1-4.

［12］陈育新，韩珍，郭庆东.中国白酒中呈香呈味物质研究进展［J］.食品研究与开发，2015，36（2）：140-142.

［13］肖冬光.白酒生产技术［M］.北京：化学工业出版社，2014.

［14］雷振河.汾酒发酵主要有机酸成分分析与产酸细菌的鉴定［J］.酿酒，2011，38（4）：24-28.

［15］吴荣荣，张志民，张煜行，等.老白干大曲中酿酒酵母Y1发酵特性的研究［J］.中国酿造，2011，30（12）：104-106.

Separation，identification and performances of acid-producing microorganism from Hengshui LaobaiganBaijiu

SUN Pengfei1，ZHANG Fuyan2，WU Haijing1，ZHU Wenzhong1*
（1.College of Biological Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China；2.Hengshui Laobaigan Distillery Group，Hengshui 053000，China）

Organic acids are important flavor components inBaijiu（Chinese liquor），and also the precursor of aroma components.Six kinds of organic acids（acetic acid，propionic acid，isobutyric acid，butyric acid，isovaleric acid and lactic acid）were determined by GC and HPLC.69 acid-production bacteria strains were separated and obtained fromDaquand fermented grains，in which the representative bacteria were 1 strain of acetic bacteria，4 strains of lactic acid bacteria and 2 strains of propionic acid bacteria.The main acid-producing bacteria were identified asWeissella cibariaby 16S rDNA，and its acid-production performance was researched preliminarily.The results showed that in the conditions of the initial pH 6.5，inoculum 7%，temperature 32℃and time 36 h，the lactic acid yield could reach up to the highest of 7.12 mg/ml.

organic acids；acid-producing bacteria；separation；identification；acid-production performance

TS262.3

0254-5071（2016）03-0036-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.009

2015-12-31

孙鹏飞（1990-），男，硕士研究生，研究方向为固态发酵技术。

朱文众（1958-），男，教授，本科，研究方向固态发酵技术。