红花注射液生物活性测定方法的建立与质量评价

冯五文，李瑞煜，董芹，章从恩，李光全，史志龙，董小萍

·炮制制剂·

红花注射液生物活性测定方法的建立与质量评价

冯五文，李瑞煜，董芹，章从恩，李光全，史志龙，董小萍

目的：建立基于生物活性测定的红花注射液质量评价方法，探究红花注射液不良反应的物质基础。方法：建立挑丝法测定不同批次的红花注射液对凝血酶的抑制作用；采用紫外分光光度法测定不同批次红花注射液中总黄酮；采用相关分析考察抗凝血酶效价与总黄酮之间的相关性。结果：部分不良反应批次的红花注射液抗凝血酶活性比正常批次强；抗凝血酶活性与总黄酮含量有显著相关。结论：所建立的基于抗凝血酶活性的红花注射液质量评价方法重复性好，灵敏简便，可作为现行红花注射液质量控制标准的补充方法；红花注射液的不良反应与总黄酮含量有关，总黄酮含量过高为部分红花注射液引起不良反应的原因。

红花注射液；生物活性测定；凝血酶；不良反应；紫外分光光度法

红花注射液是由菊科植物中药红花（Carthanus tinctorius L.）经现代制药工艺制成的中药注射剂，具有抗凝血、抑制血栓形成、降血压等作用，临床主要用于心脑血管性疾病，如冠心病、心绞痛、肺心病心力衰竭、脑梗死等。尽管在临床中得到了广泛的应用和药理效应的肯定，然而临床上关于红花注射液不良反应的报道却呈现出上升趋势。2012年，国家食品药品监督管理局发布的《药品不良反应信息通报》（第52期）通报警惕红花注射液的不良反应，红花注射液引发不良反应的问题已经成为关乎人民群众安全的亟需解决的问题。

中药注射剂的质量与不良反应的发生有着密切的关系，如何有效控制红花注射液的质量已经成为当前的一个重要的挑战。红花的药材来源相对广泛，制备工艺复杂，活性成分多，导致目前广泛采用的监测少数常规化学成分的含量测定或指纹图谱的方法不能很好的控制红花注射液质量和临床疗效，因此，建立新方法以对红花注射液的质量进行补充控制具有十分重要的意义。按照2010版《中国药典》中的《中药生物活性测定指导原则》，本文建立了基于抗凝血酶作用的红花注射液质量评价方法，该方法灵敏简便，可作为现行红花注射液质量控制的补充控制方法。

1 材料

凝血酶（sigma：T4648，批号：20130805229），纤维蛋白原（sigma：F8630，批号：01401015266），生理盐水（石家庄四药有限公司，批号：1408023203），山奈酚（中国药品生物制品检定所，批号：110861-200405）；亚硝酸钠、氢氧化钠为分析纯；紫外分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表有限公司）；红花注射液由四川雅安三九药业有限公司等提供。

2 方法

2.1溶液的配制

取纤维蛋白原粉末适量，溶解于37℃保温的生理盐水中，制成最终浓度为0.5％（凝固物计）的纤维蛋白原溶液。取适量凝血酶标准品，以生理盐水溶解并定量稀释配制成5.0、6.4、8.0、10.0、12.0 U·mL-1的标准品溶液。取红花注射液，用生理盐水按一定体积比将红花注射液稀释成原溶液的1/2、1/3、1/4、1/5、1/8、1/10浓度。

2.2凝固时间检测

取96孔板，固定于37℃恒温水浴中，同时避免水浴锅中水进入96孔板。用排抢每孔加入纤维蛋白原溶液100 μL，并每孔加入稀释或未稀释的红花注射液50 μL，搅拌，孵育一定时间后，加入凝血酶溶液10 μL，搅拌混匀，用排枪枪头反复接触溶液液面，记录每孔从搅拌混匀到能从溶液中拉出细丝的时间（成丝时间）。采用生理盐水作空白对照，记录空白对照的成丝时间。每次实验重复8孔，求成丝时间平均值（最大值与最小值的差不得超过平均值的10％，如果超过则舍弃该值）。

2.3总黄酮含量测定

参照文献［1］，采用紫外分光光度法测定不同批次红花注射液中总黄酮Y的含量。吸光度X与总黄酮含量的标准曲线方程Y= 0. 0863 X + 0. 1072，r2=0.9942。

2.4红花注射液抗凝血酶的效价计算

设凝血酶标准品的效价为U1，加入红花注射液后实际测得的凝血酶效价为U2，则红花注射液抗凝血酶的效价U计为U= U1- U2。

2.5相关性分析

采用SPSS 20.0 对红花注射液中总黄酮和抗凝血酶效价进行Pearson相关分析。

3 结果

3.1凝血酶加入量考察

凝血酶的加入量对成丝时间的长短具有重要影响，为保证实验操作的方便性与省时性，成丝时间不能过长或过短。分别考察了5、10、20、30 μL的凝血酶加入量，发现加入5.0-10.0 U·mL-1的凝血酶10 μL时，成丝时间在60 s至180 s之间，适合实验有序操作，故选择凝血酶的加入量为10 μL。

3.2红花注射液稀释度考察

取不同稀释度的红花注射液，按2.2项下凝固时间检测法检测，记录加入不同稀释度的红花注射液后溶液的成丝时间。结果表明，当稀释至原溶液的1/3浓度时，溶液成丝时间为100 s左右，适合实验操作，故选择1/3浓度为后续实验浓度。

3.3孵育时间考察

考察了0、5、10、20、30 min作为纤维蛋白原溶液与红花注射液的孵育时间，结果表明，孵育时间对成丝时间及成丝能力等无明显影响，故选择0 min为孵育时间。

3.4方法学考察

3.4.1线性关系考察 取5.0、6.4、8.0、10.0、12.0 U·mL-1的标准品溶液，按2.2项下凝固时间检测法检测，记录溶液成丝时间。以标准品的效价的对数（X）为横坐标，平均成丝时间的对数（Y）为纵坐标，进行直线回归，得效价与平均成丝时间的对数的回归方程为Y= -0.9205 X + 2.8942，r2=0.9932。

3.4.2精密度试验 取10.0 U·mL-1的标准品溶液，按2.2项下方法连续6次测定溶液成丝时间，记录每次测定的平均成丝时间，计算得平均成丝时间的RSD为4.7％。

3.4.3稳定性试验 取10.0 U·mL-1的标准品溶液，在纤维蛋白原溶液配制完成的0、1、2、4、8 h时按2.2项下方法进行平均成丝时间的测定。同法考察凝血酶溶液在配制、红花注射液在开封0、1、2、4、8、12 h时使用的平均成丝时间。结果表明，纤维蛋白原溶液在8 h内基本稳定，凝血酶和红花注射液在开封12 h内基本稳定，因此，后续实验均在纤维蛋白原溶液配制的8 h内进行。

3.4.4中间精密度试验 按2.2项下方法，考察不同实验人员对测定结果的影响，计算得不同人员测定的平均成丝时间的RSD为4.8％。说明不同实验人员对方法的结果影响较小，方法的稳定性较好。

3.5不同批次红花注射液抗凝血酶效价及总黄酮的测定

在确定方法学的可靠性后，测定不同厂家、不同批次的红花注射液的抗凝血酶的效价以及其中的总黄酮含量，结果见表1。结果表明，不良反应批次间的红花注射液抗凝血酶效价及总黄酮含量具有较大差异性，而正常批次的红花注射液的抗凝血酶效价及总黄酮含量的差异较小。

3.6红花注射液抗凝血酶活性与化学成分间的相关性

将所有批次的红花注射液抗凝血酶效价与对应的总黄酮含量作图，见图1。并按2.5项下方法进行相关性分析，相关性系数0.898。结果表明，红花注射液的抗凝血酶效价与总黄酮含量之间有显著相关性。

图1　红花注射液总黄酮含量与抗凝血酶效价的相关性分析

4 讨论

目前，生物评价为中药质量控制的发展方向［2-3］，这以《中国药典》2010版附录《中药生物活性测定指导原则》为明确的信号标志。因此，本文从生物评价角度研究红花注射液的质量评价方法。目前，活血化瘀类中药一般从以下方法进行生物活性测定研究［4］：①家兔/大鼠离体动脉环（条）收缩试验；②血小板聚集试验；③凝血时间的测定，如活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）等；④大鼠动脉血栓形成时间。鉴于上述方法均需要实验动物与一般实验室不能配备的实验仪器，同时实验过程操作复杂，实验结果影响因素多，本文尝试采用体外（非动物）实验对红花注射液进行质量评价。实验采用的凝血酶是体内凝血、血栓形成过程的关键酶，在脑梗死等心血管疾病过程中发挥着关键作用。红花注射液中的主要成分为黄酮类及黄酮类色素类成分［5］，文献报道，黄酮类成分包括红花注射液中的槲皮素具有抗凝血酶的作用［6-7］。因此，本文采用红花注射液抗凝血酶活性评价红花注射液质量。

关于凝血酶活性测试的方法有很多，比如发色底物法等，但这些方法所需材料昂贵。参考《中国药典》2010版第二部凝血酶的质量控制方法，本文做了改进，使所需的实验材料更少，实验耗时更少，实验准确度更高，所建立的方法稳定、重复性好、操作简便，所采用的紫外分光光度仪也为实验室配置的常规仪器，该方法用于红花注射液的质量控制时具有很强的实用价值。同时，所建立的方法对改进《中国药典》中一部水蛭和二部凝血酶的质量控制均具有参考借鉴意义。

为更好地与临床结果相结合，比较了8批有不良反应的样品与10批正常样品。由实验结果可知，10批正常样品的总黄酮含量波动相对较小，而8批不良反应样品的总黄酮含量相对波动较大。其中，有5批不良反应样品的总黄酮含量远远高于正常样品的总黄酮含量，与文献［8］等报道红花注射液中成分含量波动大相一致。据报道，红花注射液的不良反应的表现之一为出血［9］，与西药肝素、华华林等抗凝药具有一致性，同时，肝素等凝血酶抑制剂的主要不良反应表现也为出血等症状，而且与用药剂量有关［10～11］，提示红花注射液的不良反应有部分是由于活性成分过多引起。5批不良反应样品的总黄酮含量较高，提示这些批次的不良反应主要是由于其中有效成分含量过高、对凝血酶抑制作用过强，这种原因符合文献［12］的推测原因及活血化瘀药“中病即止”的原理。目前，红花注射液的质量标准中规定了总黄酮的含量下限，但未规定含量上线，导致药品生产厂家的产品有效成分过多，出现不良反应。因此，同有毒类中药附子、马钱子等一样，我们建议《中国药典》增加红花注射液中的总黄酮含量上限。同时，本文结果对其它的活血化瘀类中药注射剂如丹红注射液等的质量标准制定也具有参考价值。

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（责任编辑：陈思敏）

Bioactivity detection method development and quality evaluation of safflower injection/

FENG Wu-wen， LI Rui-yu，DONG Qin， ZHANG Cong-en， LI Guang-quan， SHI Zhi-long， DONG Xiao-ping//（ Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， Sichuan）

Objective: To establish a bioassay method to evaluate the quality of safflower injection and to explore the constituents related to adverse reaction of safflower injection. Method: With fibrinogen as enzyme substrate， safflower injection as enzyme inhibitor， thrombin as work enzyme， the abilities of different batches of safflower injection in inhibiting the thrombin were determined. The total flavonoids were determined by ultraviolet spectrophotometry. The correlation between antithrombase potency and total flavonoids were analyzed.Result: There were significant difference in the inhibit ability of different batches of safflower injection. Some abnormal samples showed stronger inhibit ability than normal samples. Correlation analysis indicated that there were strong correlation between inhibit ability of safflower injection and total flavonoids. Conclusion: The method established possesses the characteristics of good reproducibility， high sensitivity， simplicity and convenience， and can serve as a supplementary method to control the quality of safflower injection. The adverse reaction of safflower injection is related to total flavonoids content. High content of total flavonoids is a part of the reasons for adverse reaction of safflower injection.

Safflower injection； bioassay； thrombin； adverse reaction； ultraviolet spectrophotometry

·药理毒理·

R 283

A

1674-926X（2016）03-013-03

成都中医药大学，四川 成都 611137

冯五文，在读硕士研究生，主要从事中药有效成分及质量标准研究 Email：jiaoxiake-1@foxmail.com

董小萍，教授，主要从事中药质量评价与成分分析研究 Email：dongxiaoping11@126.com

2015-08-02