赶黄草不同浓度乙醇提取物中没食子酸含量的测定

唐勇，向小红，李国春,许红

（西南医科大学:1附属中医医院静脉用药调配中心；2药学院药理学系；3附属医院眼科，四川泸州646000）

赶黄草不同浓度乙醇提取物中没食子酸含量的测定

唐勇1，2，向小红，李国春1,许红1

（西南医科大学:1附属中医医院静脉用药调配中心；2药学院药理学系；3附属医院眼科，四川泸州646000）

目的：测定赶黄草不同体积分数乙醇提取物收率及其中没食子酸含量，为筛选更优的赶黄草提取方法提供参考。方法：①用不同体积分数乙醇采用热回流提取法提取赶黄草，得到赶黄草提取物；②采用Agilent C18色谱柱，甲醇-0.15%磷酸溶液（10∶90）为流动相，检测波长270 nm，柱温35℃，流速1.0 mL·min-1测定赶黄草提取物中没食子酸含量。结果：35%乙醇、55%乙醇、75%乙醇、95%乙醇提取得到的赶黄草浸膏收率分别为16.3%、16.6%、16.8%、9.6%，所得提取物中没食子酸含量分别为10.81 μg·mg-1、11.87 μg·mg-1、13.61 μg·mg-1、15.50 μg·mg-1。结论:75%乙醇提取赶黄草收率及提取物中没食子酸含量总量最高，95%乙醇赶黄草提取物中没食子酸浓度最高。

赶黄草；乙醇；没食子酸；含量

赶黄草（Penthorum Chinese Pursh）又名水泽兰，为虎耳草科扯根菜属植物赶黄草的干燥地上部分，主要分布与我国华东、华北、中南、陕西、四川和贵州等地，具有清热解毒、活血平肝、健脾祛黄等功效，是苗族治疗肝病的常用药物[1]。现代研究显示赶黄草还具有清除DPPH自由基、抗病毒、抗突变等药理活性[2-5]，赶黄草的化学成分主要为黄酮类、挥发油类、苷类等，已报道单体成分有乔松素7-O-β-D-葡萄糖苷、2，4，6-三羟基苯甲酸、没食子酸、槲皮素、2，6-二羟基苯乙酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等20余种[6-7]。单一组分药理实验表明，没食子酸具有抗乙肝病毒和保肝作用的成分[7-10]。因此测定赶黄草提取物中没食子酸的含量是评价提取方法以及评价提取物药理活性质量控制的重要指标，本文建立了RP-HPLC测定赶黄草不同体积分数乙醇提取物中没食子酸的含量，对比其含量差异。

1 材料与方法

1.1 实验材料

赶黄草（四川省泸州市百草堂中药饮片有限公司，批号：130606-1），无水乙醇（吉林省新天龙实业股份有限公司，批号：20130308），没食子酸（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：130711），甲醇（美国Sigma公司），甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.2 对照品溶液的配制

精密称取没食子酸标准品0.0054 g于10 mL容量瓶中，甲醇定容，得没食子酸对照品溶液，标准品浓度为0.540 mg·ml-1。

1.3 实验分组

用蒸馏水将无水乙醇按体积分数稀释为35%、55%、75%、95%四个浓度溶液备用，将实验分为35%乙醇提取物组，55%乙醇提取物组，75%乙醇提取物组，95%乙醇提取物组4个实验组及没食子酸标准品组共5个组。

1.4 供试液的制备

各实验组称取赶黄草100 g于圆底烧瓶中，加入3倍体积的对应浓度乙醇浸泡30 min后，加热回流提取2 h,所得提取物经过滤、回收乙醇、真空干燥等操作成干燥粉末待用。称取约相当于原生药1 g的提取物于50 mL容量瓶中，甲醇定容，微孔滤膜（0.45 μm）过滤即得供试品溶液。

1.5 色谱条件

色谱柱为：Agilent C18（4.6 mm×150 mm×5 μm）色谱柱，流动相为甲醇：0.15%磷酸溶液＝10∶90，检测波长270 nm，柱温35℃，流速1.0 ml·min-1，进样量10 μL。

1.6 标准曲线的绘制

精密移取没食子酸标准溶液1 mL,2.5 mL,5.0 mL,7.5 mL,10.0 mL于4只10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，即为标准曲线供试液。

按实验色谱条件，各对照品供试液分别进样，记录色谱图，以峰面积为纵坐标（A），没食子酸含量为横坐标（C）,绘制标准曲线。

2 结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

照方法1.5所示色谱条件进行试验，外标峰面积法计算没食子酸含量，理论塔板数＞5 000，没食子酸RT=7.537 min，与相邻峰分离度＞1.5，色谱图见图1。

图1 没食子酸对照品与样品色谱图

2.2 线性关系

按1.6实验方法得回归方程为：A=0.0004C-0.0059,r=0.9997，表明没食子酸浓度在0.135 mg· mL-1～0.540mg·ml-1范围内，没食子酸峰面积值（A）与浓度（C）之间呈现良好的线性关系，但由于其不过原点，因此采用外标两点法测定供试品中没食子酸含量。

2.3 精密度实验

精密吸取对照品供试液（0.540 mg·ml-1），连续进样5次，每次10 μL，测定峰面积积分值计算RSD。RSD=0.3417%，说明仪器具有良好的精密度，见表1。

表1 精密度测试实验结果

2.4 重现性实验

精密称取35%乙醇提取物0.2037g共5份，按1.5方法测定没食子酸含量，RSD=0.9288%说明该方法据有较好的重现性，见表2。

表2 重现性实验结果

2.5 加样回收实验

精密称取95%乙醇提取物0.002596 g共10份，分为两组：一组（5份）加甲醇超声溶解后甲醇定容致10 mL，按1.5方法测定没食子酸含量，另一组（5份）加入对照品溶液适量，加甲醇超声溶解后甲醇定容致25 mL，按1.5方法测定没食子酸含量，计算回收率，计算公式为：回收率（%）=（测定量-样品中含量）/加入对照品量×100%，结果得：平均回收率为100.43%，RSD=0.1262%，见表3。

表3 回收率测定结果

2.6 赶黄草不同浓度乙醇提取物收率及其没食子酸含量

按1.4方法制备供试液，按1.5色谱条件，进样量10 μL，实验重复3次，根据峰面积由回归方程计算各组供试品没食子酸含量。由表2可知，35%乙醇提取赶黄草浸膏收率为16.3%，提取物中没食子酸含量10.81 μg·mg-1，55%乙醇提取赶黄草浸膏收率为16.6%，提取物中没食子酸含量11.87 μg·mg-1，75%乙醇提取赶黄草浸膏收率为16.8%，提取物中没食子酸含量13.61 μg·mg-1，95%乙醇提取赶黄草浸膏收率为9.6%，提取物中没食子酸含量15.50 μg·mg-1，见表4。

表4 赶黄草不同浓度乙醇提取物收率及没食子酸含量的测定

3 讨论

没食子酸作为赶黄草中明确具有抗乙肝病毒和保肝作用的活性成分[11-12]，在赶黄草制剂中作为质量控制指标，对赶黄草进行现代化开发利用不可避免的需要对赶黄草进行加工提取[13-16]，而需要找到良好的提取方法及提取溶剂，提取物中没食子酸的含量是需要考察的一个重要指标[14]，本文采用RP-HPLC测定赶黄草不同体积分数乙醇提取物中没食子酸含量，由方法学考察情况看本实验所用方法可靠、稳定。

不同体积分数乙醇提取赶黄草后所得浸膏收率情况看75%乙醇提取物浸膏收率最高，95%乙醇提取物中没食子酸含量最高，从没食子酸在提取物中的含量换算所得提取物中没食子酸总量看，75%乙醇提取物中没食子酸含量总量最高。

从提取物中没食子酸含量总量看75%乙醇提取方法较好，从提取物中没食子酸含量看95%乙醇提取较优。有效成分含量是评价中药提取分离方法较为重要的参考指标，本文通过比较不同提取方法所得赶黄草提取物中没食子酸的含量，为进一步开发利用赶黄草，寻找最优提取方法提供参考。

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（2016-03-07收稿）

Determination of the content of gallic acid in ethanol extract from different concentrations of ethanol extracts from Phethorum Chinese Pursh

Tang Yong1,2,Xiang Xiaohong3,Li Guochun1,Xu Hong11PIVAS of the Affiliated TCM Hospital of Southwest Medical University,2Departmant of Prarmacolgy of Southwest Medlical University;3Ophthalmology of the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou, Sichuan Provivce,646000,China

Objective：The content of gallic acid and the recovery rate of Phethorum Chinese Pursh from different concentrations of ethanol extracts were determined in order to provide a better way to recover the Phethorum Chinese Pursh from extraction.Methods：①We use different volume fractions of ethanol were used in hot reflux extraction to extract the Phethorum Chinese Pursh extraction.②Gallic acid was analyzed by Agilent C18 column at 270nm.The mobile phase consisted of acetonitrile 0.1%phosphoric acid（10:90）,running at the velocity at 1.0 mL·min-1,and the column temperature was 35℃.Results：At the concentrations of ethanol of 35%, 55%,75%,95%，the recovery rates of Phethorum Chinese Pursh were 16.3%,16.6%,16.8%,9.6%,and the contents of gallic acid were 10.81 μg·mg-1,11.87 μg·mg-1,13.61 μg·mg-1,15.50 μg·mg-1,respectively. Conclusion：The recovery rate was the highest using 75%ethanol,whereas 95%ethanol gave the highest concentration of gallic acid.

Phethorum Chinese Pursh;Ethanol;Gallic acid;Content

R733.4

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.021

唐勇（1988-），男，硕士生，药师。E-mail:tangy1989@yeah.net