心脑疏通胶囊对心肌缺血的影响及机制初探

陈春 戴海鹰

基础研究

心脑疏通胶囊对心肌缺血的影响及机制初探

陈春 戴海鹰

目的 探讨心脑舒通胶囊对异丙肾上腺素介导的心肌缺血的保护作用与其抑制NADPH氧化酶Nox2和Nox4的关系。方法 观察心脑舒通胶囊（XNST capsule）对异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠心电图，血清乳酸脱氢酶（LDH）、磷酸肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、左心室NADPH氧化酶Nox2和Nox4表达水平的影响。结果 同对照组比较，异丙肾上腺素（ISO）诱导的模型组大鼠心电图 ST 位移值（0.27±0.05比 0.01±0.00，P<0.05）和 N-ST（9.63±0.37比 0.47±0.08，P<0.05）显著增加，血清中 LDH［（1356.0±292.8）U/L 比（640.0±145.3）U/L，P<0.05）］、CK［（978.0±223.5）U/L 比（470.0±113.7）U/L，P<0.05］和 MDA［（9.06±2.17）μmol/L 比（5.40±1.78）μmol/L，P<0.05］的蛋白水平增高，而血清中 SOD 蛋白水平明显减少［（71.0±12.8）U/ml比（107.0±16.7）U/ml，P<0.05］。与 ISO 模型组比较，心脑舒通胶囊治疗显著降低大鼠心电图 ST 位移值［0.16±0.04（低剂量组）比 0.27±0.05，P<0.05；0.13±0.03（高剂量组）比 0.27±0.05，P<0.05］和 N-ST［4.70±0.42（低剂量组）比 9.63±0.37，P<0.05；3.83±0.28（高剂量组）比 9.63±0.37，P<0.05］以及血清中 LDH［（938.0±275.9）U/L（低剂量组）比（1356.0±292.8）U/L，P<0.05；（889.0±125.6）U/L（高剂量组）比（1356.0±292.8）U/L］、CK［（607.0±137.2）U/L（低剂量组）比（978.0±223.5）U/L，P<0.05；（579.0±125.6）U/L（高剂量组）比（978.0±223.5）U/L，P<0.05］和 MDA［（6.60±1.92）μmol/L（低剂量组）比（9.06±2.17）μmol/L，P<0.05；（6.20±1.63）μmol/L（高剂量组）比（9.06±2.17）μmol/L，P<0.05］的蛋白表达水平，而心脑舒通胶囊治疗后大鼠血清中SOD蛋白水平升高［（89.0±13.9）U/ml（低剂量组）比（71.0±12.8）U/ml，P<0.05；（94.0±15.3）U/ml（高剂量组）比（71.0±12.8）U/ml，P<0.05］。此外，心脑舒通胶囊可显著降低异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠左心室中NADPH氧化酶Nox2和Nox4的表达水平。结论 心脑舒通胶囊可显著改善异丙肾上腺素诱导的心肌缺血，其机制与其抑制NADPH氧化酶Nox2和Nox4介导的氧化应激有关，为心脑舒通胶囊的临床应用提供了进一步的理论依据和实验基础。

心脑舒通胶囊； 心肌缺血； Nox2； Nox4； 氧化应激

心血管疾病是我国城市和乡村人群的第一位死亡原因[1]。我国心血管病的流行病学特征是脑卒中发病率高，冠心病发病率较低，但近20年来冠心病的发病率和死亡率逐渐增加[1]。因此，重视冠心病的防治，降低心血管疾病的死亡率，具有重要的临床价值。

适量的活性氧是机体发挥正常生理功能的必要条件，但过多的活性氧则会产生氧化应激，引起组织器官损伤。氧化应激可促进冠心病的发生发展，且氧化的低密度脂蛋白已被认为是预测冠心病发生发展的早期标志物[2,3]。NADPH氧化酶Nox2和Nox4是心肌中活性氧的主要来源，与心肌损伤密切相关[4]。心脑舒通胶囊是用于治疗冠心病的常用中成药，但其改善心肌缺血的机理目前还认识不足，尚无研究阐明心脑舒通胶囊对心肌缺血的保护作用与NADPH氧化酶Nox2和Nox4介导的氧化应激有关。因此，本研究以异丙肾上腺素介导的心肌缺血大鼠模型为研究对象，拟探讨NADPH氧化酶Nox2和Nox4介导的氧化应激是否与心脑舒通胶囊的抗心肌缺血效应有关。

1 材料与方法

1.1 实验器材、动物和药物 多道生理记录仪（中国），BECKMAN Synchron CX5自动血液生化分析仪（美国），SDS-PAGE电泳仪和转膜仪（中国），实时定量PCR仪（美国）。

清洁级SD大鼠，体重220～240 g，雄性，合格证号：SYXK（粤）2013-0020，由广州中医药大学实验动物中心提供。动物实验遵循美国国立研究院（National Institutes of Health，NIH）发布的实验动物管理和使用指南，并获得我院伦理委员会批准。心脑舒通胶囊（国药准字 Z22021965）由吉林敖东洮南药业股份有限公司提供。

1.2 制备异丙肾上腺素诱导的心肌缺血模型 取雄性SD大鼠48只，用色彩将老鼠标记号数字后，采用数字表法随机分成4组：空白对照组、异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）诱导的模型组、ISO 模型组+心脑舒通低剂量组［XNST（L）］（24.3 mg/kg）和ISO模型组+心脑舒通高剂量组［XNST（H）］（48.6 mg/kg）。方法：参照参考文献[5,6]，简要描述如下：连续给予心脑舒通胶囊28 d，于给药第26天灌胃30 min后，给药组和模型组均腹腔注射异丙肾上腺素8 mg/kg诱导心肌缺血，空白对照组给予等量生理盐水腹腔注射，连续给药3 d。

参照剂量—体表面积换算法：大鼠给药剂量（mg/kg）=人的给药剂量×大鼠转换系数/大鼠体重，以70 kg成人每天服用心脑舒通胶囊（45 mg/次，3次/d）为等效剂量，参照换算标准方程进行换算，即得大鼠等效剂量分别为12.15 mg/kg。本研究设心脑舒通胶囊的低、高剂量分别为临床等效剂量的2倍（24.3 mg/kg）和 4倍（48.6 mg/kg）。药物浓度均按大鼠1.0 ml/100 g灌胃容量用蒸馏水配制。

1.3 心电图改变的检测 心电图检测参照参考文献[7-10]，具体如下：末次给药后，用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，将其仰位固定在绑鼠板上，于四肢皮下插入针形电极，并与多道生理记录仪相接；连续测量大鼠Ⅱ导联体表心电图5 min，连续心电监测大鼠Ⅱ导联心电图（纸速50 mm/s，增益l mV=10 mm）。观察心电图ST位移值和N-ST（计算位移高于0.1 mV的数量）的改变。

1.4 血清中LDH、CK、SOD和MDA含量测定 心电图检测后，腹主动脉取血2 ml，1200 g离心5 min后取上清，然后用全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶 （lactate dehydrogenase，LDH）、磷酸肌酸激酶（creatine phosphokinase，CK）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平。

1.5 蛋白质免疫印迹检测左心室中Nox4和Nox2的蛋白水平 实验结束时，每组6只大鼠取出心脏组织，PBS漂洗后去除心房及右室组织后保存于-80℃冰箱中。用强的组织裂解液（RIPA，碧云天）提取左心室的组织蛋白，然后用蛋白质免疫印迹（western blotting）检测左心室组织中Nox4和Nox2的蛋白水平。

1.6 实时定量PCR检测Nox4和Nox2的mRNA水平 取20 mg左心室组织，用手术剪将组织剪成小块，加入1 ml Trizol后在组织匀浆机中进行组织匀浆，按照RNA提取步骤提取总RNA并逆转录生成cDNA，然后再用实时定量PCR检测Nox4的mRNA 水平。引物序列如下：Nox4：5′-AGCTGCCCACTTGGTGAACGC-3′（forward primer），5′ -TCAGGC CCGGAACAGTTGTGA-3′（reverse primer）；Nox2 引物：5′-GGGAGACTGGACTGAGGGGCT A-3′，5′-GGCGTGACTCCAATCCC AGC TC-3′（reverse primer）；GADPH；5′-ATCAAGAAGG TGGTGAAG －CA-3′（forwardprimer），5′-AAGGTGGA AGAA TGGGAGTTG-3′（reverse primer）。

1.7 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行分析。所有实验数据均以±s表示，服从正态分布，两样本统计学分析采用t检验，多样本统计学分析采用单因素方差分析。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠模型的构建 临床实践证实，心电图ST段改变以及LDH和CK的显著增加是判断心肌缺血程度的重要参数。同对照组比较，异丙肾上腺素处理的大鼠模型中心电图ST段位移值显著增加，血清中LDH和CK水平显著增加（见表1、2）。上述结果显示异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠模型已成功构建。

2.2 心脑舒通胶囊对异丙肾上腺素诱导的心肌缺血的影响 同模型组比较，心脑舒通胶囊的低、高剂量均能显著抑制异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠的心电图改变，降低血清中LDH和CK水平（见表1、2）。这提示心脑舒通胶囊可显著改善异丙肾上腺素诱导的心肌缺血。

2.3 心脑舒通胶囊对异丙肾上腺素介导的心肌缺血大鼠血清中SOD和MDA的影响 与对照组比较，模型组大鼠血清SOD表达明显下降，MDA含量显著上升；心脑舒通胶囊的低、高剂量均可明显抑制SOD的下降和MDA的上升。见表3。

表1 心脑舒通胶囊对异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠心电图改变的影响（±s）

表1 心脑舒通胶囊对异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠心电图改变的影响（±s）

注：ISO组：异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠模型组；ISO+XNST（L）组：低剂量心脑舒通治疗的心肌缺血大鼠模型组；ISO+XNST（H）组：高剂量心脑舒通治疗的心肌缺血大鼠模型组；N-ST：位移值高于0.1 mV的数量。与对照组比较，aP<0.05；与ISO组比较，bP<0.05

组别 例数 ST位移值 N-ST对照组 12 0.01±0.00 0.47±0.08 ISO 组 12 0.27±0.05a9.63±0.37aISO+XNST（L）组 12 0.16±0.04b4.70±0.42bAAC+XNST（H）组 12 0.13±0.03b3.83±0.28b

表2 心脑舒通胶囊对异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠血清中 LDH、CK 水平的影响（±s）

表2 心脑舒通胶囊对异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠血清中 LDH、CK 水平的影响（±s）

注：ISO组：异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠模型组；ISO+XNST（L）组：低剂量心脑舒通治疗的心肌缺血大鼠模型组；ISO+XNST（H）组：高剂量心脑舒通治疗的心肌缺血大鼠模型组；LDH：乳酸脱氢酶；CK：磷酸肌酸激酶。与对照组比较，aP<0.05；与ISO组比较，bP<0.05

组别 例数 LDH（U/L） CK（U/L）对照组 12 640.0±145.3 473.0±113.7 ISO 组 12 1356.0±292.8a978.0±223.5aISO+XNST（L）组 12 938.0±275.9b607.0±137.2bAAC+XNST（H）组 12 889.0±125.6b579.0±125.6b

表3 心脑舒通胶囊对异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠血清中SOD和MDA表达的影响（±s）

表3 心脑舒通胶囊对异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠血清中SOD和MDA表达的影响（±s）

注：ISO组：异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠模型组；ISO+XNST（L）组：低剂量心脑舒通治疗的心肌缺血大鼠模型组；ISO+XNST（H）组：高剂量心脑舒通治疗的心肌缺血大鼠模型组；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。与对照组比较，aP<0.05；与ISO组比较，bP<0.05

组别 例数 SOD（U/ml） MDA（μmol/L）对照组 12 107.0±16.7 5.40±1.78 ISO 组 12 71.0±12.8a9.06±2.17aISO+XNST（L）组 12 89.0±13.9b6.60±1.92bAAC+XNST（H）组 12 94.0±15.3b6.20±1.63b

2.4 心脑舒通胶囊对异丙肾上腺素介导的心肌缺血大鼠心肌中Nox2和Nox4表达的影响 与对照组比较，模型组大鼠左心室中Nox2、Nox4和mRNA水平显著增加；心脑舒通胶囊的低、高剂量均能抑制异丙肾上腺素介导的Nox2、Nox4表达上调。见图1。

3 讨论

本研究可得出以下结论：①心脑舒通胶囊可显著改善异丙肾上腺素诱导的心肌缺血。②心脑舒通胶囊可抑制SOD的下降和MDA的上升。③心脑舒通胶囊可降低左心室中Nox2和Nox4的表达水平。

中医理论认为，冠心病的病机为气滞血瘀、血脉瘀积而造成心血管疾病，将冠心病归为“胸痹”“心痛”“真心痛”“厥心痛”等范畴，其病理改变主要在于气滞、血瘀、寒凝，瘀血阻络、滞而不通，故而导致疼痛[11]。心脑舒通胶囊是刺蒺藜的全草提取物，其主要有效成分为蒺藜，具有活血化瘀、舒利血脉的功效。上述理论从中医的角度阐述了心脑舒通胶囊治疗冠心病的机理。这与我们的研究结果相符，心脑舒通胶囊能显著抑制异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠的心电图改变，降低血清中LDH和CK水平，从而改善异丙肾上腺素诱导的心肌缺血。因此，心脑舒通胶囊可显著改善异丙肾上腺素诱导的心肌缺血。

图1 心脑舒通胶囊对异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠左心室中Nox2和Nox4表达的影响

机体活性氧的平衡取决于活性氧的产生与清除间的平衡，平衡一旦被打破，则会导致氧化应激，从而引起机体损伤。丙二醛是脂质过氧化的产物，常被作为评估脂质过氧化程度的标志物。我们的结果显示心脑舒通胶囊可降低MDA水平，提示心脑舒通胶囊可减轻异丙肾上腺素诱导的氧化损伤。NADPH氧化酶Nox2和Nox4是心肌细胞中活性氧的主要来源[12,13]。本研究结果显示，异丙肾上腺素诱导的心肌缺血模型中Nox2和Nox4的表达显著增加，而心脑舒通胶囊可降低左心室中Nox2和Nox4的表达水平。超氧化物歧化酶（SOD）是参与机体活性氧清除的重要蛋白，SOD的表达越高，清除的活性氧就越多。本研究结果显示，心脑舒通胶囊可通过增加异丙肾上腺素诱导的心肌缺血大鼠血清中SOD的表达促进活性氧的清除。上述研究显示，抑制NADPH氧化酶Nox2和Nox4介导的氧化应激可能是心脑舒通胶囊发挥抗心肌缺血效应的机制之一。

综上所述，心脑舒通胶囊可显著改善异丙肾上腺素诱导的心肌缺血，其机制与其降低NADPH氧化酶Nox2和Nox4介导的氧化应激有关。这为心脑舒通胶囊的临床应用提供了进一步的理论依据，但仍需深入研究以进一步揭示其机理。

［1］国家心血管病中心.中国心血管病报告2013.中国大百科全书出版社，2014：1-11.

［2］Perrotta I，Aquila S.The role of oxidative stress and autophagy in atherosclerosis.Oxid Med Cell Longev，2015：130315.

［3］Zhang PY，Xu X，Li XC.Cardiovascular diseases：oxidative damage and antioxidant protection.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014，18：3091-3096.

［4］Matsushima S，Tsutsui H，Sadoshima J.Physiological and pathological functions of NADPH oxidases during myocardial ischemiareperfusion.Trends Cardiovasc Med，2014，24：202-205.

［5］Zhang J，Qi YF，Geng B，et al.Effect of relaxin on myocardial ischemia injury induced by isoproterenol.Peptides，2005，26：1632-1639.

［6］Karthick M，Stanely Mainzen Prince P.Preventive effect of rutin，a bioflavonoid，on lipid peroxides peroxides and antioxidants in isoproterenol-inducedmyocardial infarction in rats.J Pharm Pharmacol，2006，58：701-707.

［7］闵清，白育庭，余薇，等.山楂叶总黄酮对实验性大鼠心肌缺血的作用及其机制研究.中国现代应用药学，2011，28：95-99.

［8］Nielsen BL.ST-segment elevation in acute myocardial infarction.Prognostic importance.Circulation，1973：48：338-345.

［9］赵国昌，张国义，王孝铭.丹参对急性心肌缺血时脂质过氧化的影响.中国病理生理杂志，1987，3：197-200.

［10］张英杰，刘仁光.大鼠急性心肌缺血早期心电图QRS波群和ST 段改变.中国心血管病研究，2005，3：456-458.

［11］陆再英，钟南山.内科学.第七版.北京：人民卫生出版社，2012：170.

［12］Joseph LC，Barca E，Subramanyam P，et al.Inhibition of NAPDH Oxidase 2 （NOX2） Prevents Oxidative Stress and Mitochon-drialAbnormalitiesCaused bySaturated Fatin Cardiomyocytes.PLoS One，2016，11：e0145750.

［13］Kuroda J，Ago T，Matsushima S，et al.NADPH oxidase 4（Nox4）is a major source of oxidative stress in the failing heart.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107：15565-15570.

The effect of XNST capsule on cardiac ischemia and preliminarily mechanical studies

CHEN Chun，DAI Hai-ying.Cardiovascular Department of Changsha Central Hospital，Changsha 410000，China

Objective XNST capsule could alleviate cardiac ischemia，however，little is known about the mechanisms.The aim of this research is to explore whether NADPH oxidase Nox2 or Nox4 is involved in the protective action of XNST capsule or not.Methods Myocardial ischemia model induced by isoprenaline was used to test the effect of XNST capsule on electrocardiogram，the concentration of LDH，CK，SOD and MDA in serum，and the expression of NADPH oxidase Nox2 or Nox4 in left ventricular tissues.Results Compared with control group，ST displacement（0.01±0.00 vs 0.27±0.05，P<0.05）and N-ST（0.47±0.08 vs 9.63±0.37，P<0.05）of electrocardiogram were significantly increased in isoproterenol-induced rats，and the protein levels of LDH［（640.0±145.3）U/L vs （1356.0±292.8）U/L，P<0.05］，CK［（470.0±113.7）U/L vs （978.0±223.5）U/L，P<0.05］and MDA［（5.40±1.78）μmol/L vs （9.06±2.17）μmol/L，P<0.05］in plasma were remarkably elevated in these rats，whereas SOD protein level in plasma of isoproterenol-induced rats was notably decreased ［（107.0±16.7）U/ml vs （71.0±12.8）U/ml，P<0.05］.Compared with ISO group，treating with XNST capsule significantly reduced ST displacement［0.27±0.05 vs 0.16±0.04（low dose group），P<0.05，0.27±0.05 vs 0.13±0.03（high dose group），P<0.05］and N-ST［（9.63±0.37 vs 4.70±0.42（low dose group），P<0.05，9.63±0.37 vs 3.83±0.28（highdose group），P<0.05］of electrocardiogram,and the plasma concentration in LDH［（1356.0±292.8）U/L vs（938.0±275.9）U/L （low dose group），P<0.05，（1356.0±292.8）U/L vs （889.0±125.6）U/L （high dose group）］，CK［（978.0±223.5）U/L vs（607.0±137.2）U/L（low dose group），P<0.05，（978.0±223.5）U/L vs（579.0±125.6）U/L（high dose group），P<0.05］and MDA［（9.06±2.17）μmol/L vs（6.60±1.92）μmol/L（low dose group），P<0.05，（9.06±2.17）μmol/L vs（6.20±1.63）μmol/L（high dose group），P<0.05］，whereas there was notable elevation in SOD expression in plasma after treatment with XNST capsule［（71.0±12.8）U/ml vs（89.0±13.9）U/ml（low dose group），P<0.05，（71.0±12.8）U/ml vs（94.0±15.3）U/ml（high dose group），P<0.05］.Moreover，XNST capsule could reduce the expression of Nox2 and Nox4 in left ventricular tissues of isoprenaline-induced rats comparing with ISO group.Conclusion XNST capsule could improve isoprenaline-induced cardiac ischemia via inhibiting the oxidative stress induced by NADPH oxidase Nox2 or Nox4.These results will provide further theoretical and experimental basis for the clinical application of XNST capsule.

XNST capsule； Cardiac ischemia； Nox2； Nox4； Oxidative stress

DAI Hai-ying，E-mail：daihaiying2009@163.com

410000 湖南省长沙市，长沙市中心医院心血管内科

戴海鹰，E-mail：daihaiying2009@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．11．023

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2016）11-1048-04

2016-03-30）