松蘑提取液对D-半乳糖致衰老小鼠功能的影响*

李　娜　王利民　王海燕　许　勇　王桂华　杨　茗　栾海云

1 滨州医学院实验教学管理中心机能学实验室　烟台　264003；2 滨州医学院基础医学院解剖学教研室；3 滨州医学院药学院药理学教研室



松蘑提取液对D-半乳糖致衰老小鼠功能的影响*

李娜1王利民2王海燕1许勇3王桂华1杨茗3栾海云1

1 滨州医学院实验教学管理中心机能学实验室烟台264003；2 滨州医学院基础医学院解剖学教研室；3 滨州医学院药学院药理学教研室

目的观察松蘑提取液对D-半乳糖致衰老小鼠功能的影响。方法50只小鼠随机分成对照组、模型组和松蘑提取液低、中、高剂量组(100 mg/mL、150 mg/mL、200 mg/mL)。采用D-半乳糖复制衰老模型，检测小鼠脏器指数，学习记忆功能，测定大脑皮层和海马组织SOD、GSH-Px活性及MDA 含量。结果模型组小鼠空间学习记忆功能下降，逃避潜伏期延长；皮层和海马组织SOD、GSH-PX活性降低，MDA含量增高。松蘑提取液治疗组能明显改善衰老小鼠的空间学习记忆能力，显著提高皮层和海马中SOD、GSH-PX 活性，降低MDA 水平，呈剂量依赖性。结论松蘑提取液减轻了衰老小鼠的学习记忆障碍，其机制可能与其抗氧化作用有关。

松蘑；衰老；学习记忆；抗氧化

随着社会老龄化的日益加重，老年人的比例和数量不断上升，由衰老引起的相关疾病的发病率也明显升高。因此，与衰老相关疾病的治疗已成为研究重点。松蘑(tricholoma matsutake)是名贵的野生食用菌，性平、味甘，具有益肠胃、止痛、理气化痰之功效[1]，有“食用菌之王”的美称。由于松蘑尚不能人工栽培，野生的松蘑价格昂贵，因此野生松蘑的开发和利用成了国内外学者们的研究热点。课题组前期已经建立了D-半乳糖复制的衰老模型，考察了松蘑的抗氧化作用[2]。本研究拟通过D-半乳糖复制衰老模型，观察松蘑提取液对衰老小鼠的空间定位能力及其脑内抗氧化酶活性的影响，进一步探讨松蘑提取液对衰老小鼠脑组织的神经保护作用，为其开发和利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试剂D-半乳糖( Sigma公司)，松蘑(吉林省长白山区野生松蘑干品)，SOD、GSH-Px及MDA 试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2松蘑提取液的配制参照文献[2]的配置方法:松蘑烘干后粉碎，过40目筛，以蒸馏水为溶剂，分别称取干粉30 g、45 g、60 g，300 mL定容，摇匀，室温放置24 h，80℃水浴2.5 h， 以3 000 r/min离心悬液10 min，取上清液，即得低(100 mg/mL)、中(150 mg/mL)、高(200 mg/mL)三种浓度的松蘑提取液，4℃保存。

1.3实验动物取昆明种小鼠50只(生产许可证：SCXK(鲁)2005-0017)，由山东鲁抗医药股份有限公司动物中心提供。5周龄，雄性，体质量为(20±2)g，实验前禁食12 h，不禁水。

1.4动物分组与给药小鼠随机分为5组：对照组，模型组，药物组(松蘑提取液低、中、高剂量组)。模型组和药物组小鼠每日注射D-半乳糖200 mg/kg，对照组注射等量生理盐水, 以上各组均颈背部皮下注射给药,每日1次，连续6周[2]。从第3周开始，药物组注射D-半乳糖的同时，分别以20 mL/kg的剂量灌服低、中、高浓度的松蘑提取液，连续给药4周；对照组和模型组灌服等量的生理盐水。

1.5水迷宫实验采用Morris 水迷宫，测定小鼠空间学习记忆能力。

1.5.1定位航行实验实验历时5 d，每天训练2次。每次训练小鼠从4个不同的标记点入水。仪器自动记录小鼠寻找并爬上平台所需的时间及其轨迹图。

1.5.2空间搜索实验在第5天训练结束后，不放置水下平台，从小鼠训练时4个不同的入水点中任选一点，将小鼠放入水中，仪器自动记录小鼠在60 s内的轨迹图和第一次经过原平台的时间(潜伏期)，以及小鼠在60 s内经过原平台的次数。

1.6测定指标水迷宫实验结束后，处死小鼠，迅速在冰袋上分离其脑组织、胸腺和脾脏，计算小鼠的脏器指数。其中，脑组织还要继续分离海马和皮层组织，并分别制成10%的组织匀浆，置于高速冷冻离心机内，以4 000 r/min，4℃离心10 min，吸取上清液，用试剂盒检测其SOD、GSH-Px的活性及MDA 含量。

2　结果

2.1松蘑提取液对衰老小鼠胸腺和脾脏指数的影响脏器指数=脏器质量(mg)/体重(g)，计算小鼠的脏器指数。与对照组比较，D-半乳糖模型组的胸腺和脾脏指数均有显著性降低(P<0.05)；与模型组比较，松蘑提取液中、高剂量组的胸腺指数和脾脏指数均有显著性升高(P<0.05或P<0.01)，且呈剂量依赖性。结果见表1。

表1　各组小鼠脏器指数±s)

注：与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.2松蘑提取液对衰老小鼠空间定位记忆能力的影响与对照组小鼠比较，D-半乳糖模型组小鼠在原平台所在象限搜索时间缩短(P<0.01)，穿越原平台的次数减少(P<0.05)，表明模型组小鼠的空间记忆出现了明显的障碍，证明其空间记忆能力受到严重损害；而同模型组相比松蘑提取液中、高剂量组小鼠均能明显增加小鼠在原平台所在象限搜索时间，增加通过目标区域次数(P<0.05)，表明松蘑提取液中、高剂量组能明显改善衰老小鼠空间定位记忆能力，结果见表2。

表2　松蘑提取液对D-半乳糖致衰老小鼠空间定位记忆能力的影响±s)

注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.3松蘑提取液对D-半乳糖小鼠皮层抗氧化能力的影响与对照组小鼠比较，D-半乳糖模型组小鼠皮层SOD、GSH-PX 活性均明显降低，差异显著(P<0.05或P<0.01)，MDA含量明显增加，差异显著(P<0.01)。与模型组小鼠比较，松蘑提取液中、高剂量组小鼠皮层中SOD、GSH-PX 活性明显提高，差异显著(P<0.05或P<0.01)，MDA含量相明显降低，差异显著(P<0.01)，MDA含量随着松蘑提取液浓度的增大降低得更加显著(见表3)。

表3　松蘑提取液对D-半乳糖致衰老小鼠皮层SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响

注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.4松蘑提取液对D-半乳糖致衰老小鼠海马抗氧化能力的影响D-半乳糖模型组小鼠海马中SOD、GSH-PX活性较对照组明显降低(P<0.05或P<0.01)，而MDA 含量较对照组显著升高(P<0.01)。松蘑提取液中、高剂量组小鼠海马SOD、GSH-PX活性相对于模型组明显提高(P<0.05或P<0.01)，而MDA 含量相比较于模型组，其含量明显降低(P<0.05或P<0.01)(见表4)。

表4　松蘑提取液对D-半乳糖致衰老小鼠海马SOD、GSH-Px活性及MDA 含量的影响

注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

3　讨论

机体衰老是正常生理功能随年龄增长而衰退的过程，受诸多因素影响，在衰老机制研究中自由基损伤学说占有重要地位[3-5]。自由基是生物体新陈代谢过程中产生的一类具有氧化活性的阴离子，其化学性质相当活跃[6]。机体自由基学说认为：机体细胞代谢过程中不断产生自由基，自由基在体内不断积累，超过一定量时，会引发脂质过氧化作用，破坏细胞的膜结构，导致细胞功能失常甚至死亡[3]，进而导致机体的衰老。

研究表明，胸腺指数和脾脏指数在一定程度上可间接反映衰老状况[7]。本实验结果显示，模型组小鼠较对照组，胸腺指数、脾脏指数显著降低；而松蘑提取液组胸腺指数、脾脏指数明显增加，表明松蘑提取液有可能降低衰老引起的器官萎缩，延缓衰老过程。

水迷宫结果显示模型组小鼠的逃避潜伏期延长，通过目标区域次数减少，表明模型组小鼠认知功能下降，造模成功。而松蘑提取液组小鼠逃避潜伏期介于对照组和模型组之间，松蘑提取液能提高衰老小鼠的空间定位记忆能力，通过目标区域次数增加，表明松蘑提取液组小鼠明显改善衰老小鼠的空间定位记忆能力。

酶活性测定结果显示松蘑提取液中、高剂量组均能显著升高小鼠皮层和海马中SOD和GSH-Px活性，降低MDA的含量。揭示了松蘑提取液能有效清除衰老机体过多的自由基，保护脑细胞免受氧化损伤，延缓衰老。因此，松蘑提取液具有增强衰老小鼠神经细胞抗氧化能力，减轻衰老小鼠的学习记忆障碍。

[1] 廖丽娟,金光洙.松茸的化学成分及其药理作用的研究进展[J].中国野生植物资源,2010,29(1):12-14.

[2] 栾海云,王桂华,许勇,等. 松蘑提取液对衰老小鼠抗氧化作用的研究[J].安徽农业科学,2012,40(15):8471-8472.

[3] 马庆华,张鹏霞,郭红艳,等.白术多糖对D-半乳糖致衰老大鼠神经细胞抗氧化作用研究[J].中国老年学杂志,2006,26(12):1658-1660.

[4] Wan Q Y.Effect of Dipsacus total saponins on the ability of learning and memory and acetylcholine metabolism of hippocampus in AD rats[J].Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi,2015,31(1):82-84.

[5] Chai H J,Xu S M.Damage effects of sleep deprivation on myocardium and its antioxygen index in rats[J].Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi,2008,24(1):71-76.

[6] 陈瑾, 李荣亨. 衰老的自由基机制[J].中国老年学杂志,2004,24(7):677-679.

[7] Foster P M,Auton T R.Application of benchmark dose risk assessment methodology to developmental toxicity: an industrial view[J].Toxicol Lett,1995,82-83(S6):555-559.

Effects of tricholoma matsutake extracting solution on function of D-galactose induced mice

LI Na1WANG Limin2WANG Haiyan1XU Yong3WANG Guihua1YANG Ming3LUAN Haiyun1

1 Experimental Teaching Management Center,Binzhou Medical University,Yantai 264003,P.R.China;2 Department of Anatomy,College of Basic Medicine,Binzhou Medical University;3 Department of Pharmacology,College of Pharmacy,Binzhou Medical University

ObjectiveTo investigate the effects of tricholoma matsutake extracting solution on learning memory and anti-oxidative ability of mice induced by D-galactose.MethodsThe mice were divided into a control group,D-galactose model group,and three tricholoma matsutake extracting solution treatment groups.We copied the aging mice model with D-galactose.Spatial learning and memory ability was examined using Morris water maze test after drug administration.The activities of SOD,GSH-PX and the level of MDA in mice brain were determined using biochemical method.ResultsThe results showed that model group not only caused degression of spacial cognition ability，but also damage of anti-oxidative ability in the brain of mice．After tricholoma matsutake extracting solution administration, SOD and GSH-Px activity in brain increased,while MDA level decreased with a dose dependent manner.ConclusionAll these suggested that tricholoma matsutake extracting solution can improve the mice's abilities of memory, and the mechanism may be correlated with the anti-oxidation.

tricholoma matsutake,aging,learning and memory,antioxygen

山东省高校科技发展计划项目(J13LM07)

栾海云，E-mail：bluehy2000@126.com

R285.5

A

1001-9510(2016)04-0245-03

2016-03-17)