基于TLH重组蛋白单抗的磁性免疫层析试纸条构建

刘莹莹，翁仕强，卢 瑛，赵 勇，潘迎捷（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306）

基于TLH重组蛋白单抗的磁性免疫层析试纸条构建

刘莹莹，翁仕强，卢 瑛*，赵 勇，潘迎捷
（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306）

为了检测不耐热溶血毒素TLH，以His-TLH重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术制备TLH单克隆抗体，然后将纯化后的单抗与磁珠偶联制备免疫磁珠，以此免疫磁珠为标记物构建了TLH重组蛋白的磁性免疫层析检测试纸条。结果表明，该磁性免疫层析试纸条实现了TLH重组蛋白的快速定性和定量检测，具有快速、操作简便、灵敏度高（检测限12.5 ng/mL）等特点。本研究所构建的磁性免疫层析试纸条为重组溶血毒素的快速鉴定、诊断和检测提供了一种新途径。

副溶血性弧菌；不耐热溶血毒素；单克隆抗体；磁性免疫层析试纸条

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一种嗜盐、革兰氏阴性杆状菌，广泛分布于海洋环境和各种海产品中，食用污染该菌而又未经良好加工处理的海产品会引发突发性食物中毒，可导致伤口感染、肠痉挛、败血症、腹泻、头痛和恶心等反应［1-6］。副溶血性弧菌最重要的毒力因子是其产生的多种溶血毒素，主要有耐热的直接溶血毒素（Thermostabledirect hemolysin，TDH），耐热的直接相关溶血毒素（TDH-related hemolysin，TRH）和不耐热溶血毒素（Thermolabile hemolysin，TLH）［7-8］。已有很多报道以 TDH和TRH为目标对象开展了研究［9-11］，然而，并不是所有的VP中都含有这两种溶血毒素。研究发现TLH广泛存在于VP中，且tlh基因具有种属特异性，因此，该基因可作为鉴定识别VP菌株的目标基因［12-13］。

目前对TLH检测的研究主要有两种方式，一是建立tlh基因分子生物学和免疫学检测方法［14-16］；二是克隆重组tlh基因，对其进行原核表达［17-18］，尽管这些方法有较好的灵敏度和特异性，但是其均需要昂贵的仪器设备以及高技术操作，并且检测时间较长。免疫层析技术是上世纪80年代初期发展起来的一种快速检测技术，其基本原理是将生物分子附上标志物，依赖标志物的颜色或发出的光电磁等信号放大效应进而使得微观免疫反应的可被检出或宏观可视，实现检测目标物质的目的［19］。目前各种示踪材料发展迅速，包括胶体金、稀土元素、荧光微球、量子点、磁珠等［20］。磁性免疫层析技术以免疫磁珠（Immunomagenetic beads，IMBs）作为标记物，近年来，已有人类免疫缺陷病毒（HIV）、人血清Fe蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒等研究报道［21］。磁性免疫层析试纸条和其他试纸条最大的区别在于，可用磁信号阅读仪对检测线和质控线上的磁信号进行读取，由于磁信号具有“穿透性”，仪器对磁信号的检测不受膜厚度的影响，能够检测捕获区域内近100%的磁信号，且磁信号不易受生物材料干扰，因而其检测灵敏度高，结果的判定更为准确［22］。

本研究利用实验室已建立的His-TLH重组融合表达体系及其诱导表达方法，将分离纯化后的His-TLH重组蛋白免疫小鼠，制备了纯度较高、特异性良好的单克隆抗体，利用TLH单抗与磁性纳米材料偶联制备了免疫磁珠；并以此免疫磁珠为标记物构建了TLH重组蛋白的磁性免疫层析检测试纸条，探讨了TLH单抗在定性和定量检测TLH重组蛋白方面的应用可行性，为今后进一步建立快速简便的VP现场检测方法奠定了基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 4—6周龄BALB/c小鼠购自西普尔必凯公司；小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14购自上海麦莎公司。

1.1.2实验菌株 副溶血性弧菌ATCC 33846购自中国科学院微生物研究所。

1.1.3主要试剂耗材 氧化硅纳米磁珠（100 nm）购自上海奥润微纳新材料科技有限公司；硼酸，四硼酸钠，Tween-20，牛血清白蛋白（BSA），购自上海生工；辣根过氧化酶（HRP）标记羊抗鼠IgG，邻苯二胺（OPD）片剂购自SIGMA公司；胎牛血清（FBS）、HAT、降植烷、抗体亚类鉴定试剂盒购自SIGMA公司；细胞培养所用耗材均购自CRONING公司；RPMI-1640培养基购自GIBCO公司；蛋白脱盐柱、IgG抗体纯化柱购自GE公司。NHS，EDC购自上海延长生化科技发展有限公司；MES购自Alafa公司；硝酸纤维素膜，样品垫，结合垫，吸水纸购自上海捷宁生物科技有限公司；磁性分析仪购自美国Magna Bioscience公司。

1.2His-TLH重组蛋白的单抗制备、纯化及其性能表征

1.2.1单克隆抗体的制备 His-TLH重组融合表达体系的构建及其诱导表达参照翁仕强等［18］实验室的方法并运用割胶回收法［23］进行重组蛋白的纯化。单抗的制备采取何勇琴［24］的方法进行，以纯化的His-TLH为抗原对4—6周龄雌性BALB/c小鼠分别进行2次腹腔免疫和1次尾静脉强化免疫。抗原注射量分别为30μg和15μg。静脉注射后第三天将免疫小鼠的脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按照Köhler等［25］建立的方法进行细胞融合。采用RPMI-FCS-HAT培养基进行阳性杂交瘤细胞的筛选，取筛选得到的细胞培养上清进行ELISA检测，阳性杂交瘤细胞株通过无限稀释法［26］进行细胞克隆。

1.2.2His-TLH单抗的大量制备与纯化 选用雌性BALB/c小鼠，采用常规小鼠腹水法大量制备TLH单抗。所得腹水于37℃放置1 h后4℃过夜保存，然后20 min离心（4℃，3 000 r/min），所得上清液用50%硫酸铵进行富集，然后利用IgG抗体亲和层析柱进行纯化，得到TLH单克隆抗体。运用IsoQuickTM Kit for Mouse Monoclonal Isotyping试剂盒鉴定单抗的亚类型。

1.2.3酶联免疫吸附法（ELISA） 本研究采用间接ELISA法进行小鼠抗血清的效价检测和杂交瘤细胞的筛选。首先以10μg/mL的TLH重组蛋白为抗原包被酶标板，100μL/孔；然后每孔加入150μL PBS（pH 7.4）溶液洗涤3次后，加入250μL封闭液（含2%BSA的PBS），37℃反应1.5 h后用PBS洗涤三次；随后加入100μL的抗血清稀释液或杂交瘤细胞培养上清作为一抗，37℃反应1 h；经PBS洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗（1∶10 000），100μL/孔，37℃反应1 h；然后加入100μL的OPD底物显色液，室温反应10—30 min；最后每孔加入50μL终止液（2 mol/L H2SO4），用酶标仪测量490 nm的吸光值。

1.2.4单克隆抗体的特异性检测 首先以本研究室构建并表达获得的His-TLH、His-TDH、His-TRH、His-ALGL为抗原，杂交瘤细胞培养上清为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗的ELISA法分析所得单抗对其他重组蛋白的特异性反应。其次用竞争ELISA法探讨了单抗对TLH重组蛋白的特异性反应。即1∶1 000稀释后，取100μL分别与400μL不同浓度（1 300 mg/mL、130 mg/mL、13 mg/mL、6.5 mg/mL、1.3 mg/mL、0.13 mg/mL、0.013 mg/mL）的TLH重组蛋白在垂直混合仪上反应45 min，然后将该混合反应液作一抗100μL/孔。以100μL TLH单抗加400μL PBS作为对照样本，其余部分操作同间接ELISA法。

1.3TLH重组蛋白的磁性免疫层析检测

1.3.1免疫磁珠的制备 免疫磁珠的制备参照黄韵仪等［27］的方法进行。先用EDC和NHS活化磁珠上的羧基，然后加入一定量的His-TLH抗体与磁珠偶联，经活化缓冲液（10 mmol/L MES，0.05%（v/v）Tween-20，pH 5.0）和偶联缓冲液（5 mmol/L BS，0.05%（v/v）Tween-20，pH 9.0）洗涤后，最后加入BSA对磁珠上未偶联抗体的位点进行封闭，封闭后放入保存液中保存待用。

1.3.2免疫层析试纸条的制备 按照PVC板、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、吸水纸的顺序依次组装试纸条，T线喷涂300 mg/L His-TLH，C线喷涂1 mg/mL的羊抗鼠IgG，30℃烘干后在硝酸纤维素膜上贴上覆膜，将组装完成的试纸条进行切割，每条宽0.5 cm，于干燥处保存［28］。

1.3.3试纸条的特异性检测 于结合垫上添加5μL免疫磁珠，然后分别加100μL（0.5g/L）的His-TLH、His-TDH和His-ALGL于样品垫上，对照组加等量0.01 mol/L PBS。待液体完全跑到吸水纸顶端后，将试纸条与卡槽组装，放入磁性分析仪检测T线、C线磁信号。

1.3.4磁性免疫层析试纸条对TLH重组蛋白的定量分析 5μL免疫磁珠加在结合垫上，然后样品垫上分别加100μL系列梯度稀释的His-TLH（0.01—50μg的His-TLH），对照组添加100μL的10 mmol/L PBS。待液体完全跑到吸水纸顶端后，将试纸条与卡槽组装，放入磁性分析仪检测T线、C线磁信号。

2　结果与分析

2.1His-TLH单克隆抗体的制备与纯化

三次免疫后，免疫小鼠血清效价达到1∶17 500。细胞融合后10d计算得平均融合率为21.9%。有融合细胞的孔经ELISA检测，得到1个阳性细胞孔TLH-DB2。然后经过三次克隆筛选，最终得到1株TLH抗体细胞株。筛选完成的抗体细胞株培养上清经抗体亚类鉴定试剂盒鉴定，结果为IgG1，K轻链。腹水先后经50%硫铵和IgG抗体亲和层析柱纯化后，样品纯化结果显示，只出现重链和轻链两条带，因此，得到的His-TLH单抗纯度比较高。

2.2单克隆抗体的特异性表征

由表1可知，His-TLH抗体对His-TLH抗原具有特异性反应，对His-TDH、His-TRH、His-ALGL均无交叉反应。

表1　TLH-DB2抗体的间接　ELISA分析结果Table 1　Result of indirect ELISA of TLH-DB2 antibody

图1　TLH-DB2竞争抑制曲线Fig.1　Competitive inhibition curve of TLH-DB2

竞争ELISA结果如图1所示，随着His-TLH重组蛋白竞争抗原量的增加，OD490值逐渐下降，当竞争抗原量在适宜范围内时，OD490值呈线性变化，线性区间为1.3—10 mg/mL。

2.3磁性免疫层析试纸条的特异性检测

由图2可知，His-TDH、His-ALGL阴性样品与空白PBS的T线颜色深度相当，经检测，磁信号值皆超过1 000，而His-TLH组的T线肉眼不可见，检测所得磁信号值低于100。由此可见，His-TLH的竞争性免疫试纸条对组氨酸和TDH均无交叉反应，对TLH具有较好的特异性反应。

2.4 磁性免疫层析试纸条对His-TLH重组蛋白的定量分析

由图3可以看出，随着His-TLH重组蛋白浓度的减少，T线颜色逐渐加深。取阴性T线磁信号与样品T线磁信号的差值为纵坐标，His-TLH浓度的对数为横坐标建立TLH蛋白的定量曲线（图4）。从肉眼观察，该方法的定性检测限在30 mg/L，利用磁信号分析仪进行定量分析，其定量检测线性范围为0.01—50μg/mL，根据定量曲线以3倍空白值的标准偏差计算His-TLH的理论定量检测限为12.5 ng/mL，比定性灵敏度提高了2 000多倍。

图2　试纸条的特异性检测结果Fig.2　Result ofspecificdetection by immunochromatographic teststrip

图3　磁性免疫层析试纸条定量检测　TLH重组蛋白Fig.3　Quantitativelydetecting TLH recombinant protein by MITS

图4　TLH重组蛋白磁性免疫层析试纸条定量曲线Fig.4　Quantitative curve of TLH recombinant protein by MITS

3　讨论

微生物检测的方法主要包括传统培养法、免疫学方法、分子生物学法等［29］。免疫学方法由于其准确、可靠、快速、特异、成本低的特点，适合于大批样品的快速筛选和检测，具有广泛的应用前景。而在免疫学检测方法开发中，高度特异性的单抗是关键要素之一。

基于TLH在VP中存在的广泛性和种属特异性，本研究尝试了以重组蛋白His-TLH为抗原制备获得了TLH的单克隆细胞株（TLH-DB2细胞株），研究发现TLH-DB2单抗对TLH重组蛋白具有高特异性反应。采用His-TLH特异性单抗和磁性纳米材料构建的免疫磁珠，本研究构建了基于His-TLH的竞争性免疫层析试纸条。初步性能表征表明His-TLH单抗可以特异性检测His-TLH重组蛋白，并可快速简便地进行定量检测（检测限为0.0125 mg/L）。对水产品过敏原的检测表明磁性免疫层析法稳定性强，其磁信号在25℃条件下保存2年变化率 ＜10%［30］，且该方法操作简便，定性检测在5—10 min左右，定量检测约30 min，因而可作为分子生物学工具，应用于重组溶血毒素的鉴定或检测等研究领域。

本研究所获TLH单抗对TLH重组蛋白表现出较高的特异性，可作为分子生物学检测工具，如对重组溶血毒素进行定性或定量检测。此外，本研究中建立的免疫层析试纸条检测方法是在为进行任何优化条件下的一种应用探讨，今后可通过优化抗体偶联量、层析体系等来提高其检测灵敏度，为开发重组溶血毒素的快速诊断和检测提供支撑。

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（责任编辑：程智强）

Establishment of magnetic immunochromatographic teststrip based on monoclonal antibody against recombinant protein TLH

LIU Ying-ying，WENGshi-qiang，LU Ying*，ZHAO Yong，PAN Ying-jie
（Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Products Processing&Preservation，College of Foodscience&Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

In order todetect thermolabile hemolysin（TLH），the recombinant protein His-TLH was used to immunize a BALB/c mouse，the monoclonal antibody（MAb）against recombinant protein TLH was prepared by hybridoma technique，and then the purified MAb was conjugated with magnetic beads to prepare immunomagnetic beads（IMBs），thus a magnetic immunochromatographic teststrip（MITS）being established by taking the IMBs as labels for His-TLH.The test resultshowed that the MITS could be used for qualitative and quantitative assay of recombinant protein TLH，havingsuch advantages assimplicity，rapidity and highsensitivity（thedetection limit：12.5 ng/mL）.Thedeveloped MITS in thisstudy also provides a new means of rapid identification，diagnosis anddetection of recombination hemolysin.

Vibrio parahaemolyticus；Thermolabile hemolysin；Monoclonal antibody；Magnetic immunochromatographic teststrip

R446.6

A

1000-3924（2016）04-076-05

2015-06-01

上海市科技兴农重点攻关项目［沪农科攻字（2009）第6-1号〛；上海市科学技术委员会部分地方院校能力建设项目（11310501100）；上海市科委工程中心能力提升项目（16DZ2280300）

刘莹莹（1989—），女，在读硕士，研究方向：食品生物技术。E-mail：liuyingying0112@163.com

，Tel：021-61900503，E-mail：y-lu@shou.edu.cn