光学纯3-羟基丁酸乙酯制备技术研究进展

侯　静，孙　婧，何军邀，黄　金，王　普*（.浙江工业大学药学院，浙江　杭州 3004；.浙江医药高等专科学校，浙江　宁波　3500）

光学纯3-羟基丁酸乙酯制备技术研究进展

侯静1，孙婧1，何军邀2，黄金1，王普1*
（1.浙江工业大学药学院，浙江杭州 310014；2.浙江医药高等专科学校，浙江宁波315100）

光学纯3-羟基丁酸乙酯（EHB）是具有广泛应用价值的手性中间体，目前有多种制备方法。主要综述了手性3-羟基丁酸乙酯的合成和拆分制备研究进展，概述相关的手性拆分，不对称合成制备方法，重点介绍了生物不对称合成法制备技术的研究现状。

光学纯3-羟基丁酸乙酯；手性中间体；拆分；不对称合成

0　引言

3-羟基丁酸乙酯 （ethyl-3-hydroxybutyrate，EHB），分子式C6H12O3，相对分子质量 132.16；沸点170℃，闪点77℃；易溶于水，是一种无色粘稠液体，呈果香、葡萄香和类似白酒的香气；天然品存在于白酒、朗姆酒、鸡蛋果等。

3-羟基丁酸乙酯分子中含有羟基和酯基两个功能性官能团，可用来制备许多天然产品和药物制剂。3-羟基丁酸乙酯（EHB）本身可经过酯交换缩聚用于制备热塑材料聚3-羟基丁酸乙酯（PHB），以PHB为基体，与PLC、PLA、淀粉或纤维素形成的共混物均是具有良好生物相容性和易于降解的生物材料，广泛应用于医药、化工和光学材料的制备［1］；EHB也可被还原成1，3-丁二醇，用作有机合成增塑剂、涂料、染料的中间体［2］。光学纯3-羟基丁酸乙酯因其具有特定官能团，是合成手性药物，手性农用化学品及香料等物质的重要中间体：（S）-3-羟基丁酸乙酯（（S）-EHB）是合成灰绿霉素、格哈菌素、卡包霉素、核球壳菌素、食菌甲诱醇、香矛醇、熏衣草醇等天然产物的手性源；（R）-3-羟基丁酸乙酯（（R）-EHB）可用于制备β-内酰胺酶抑制剂、昆虫信息素、噻烯霉素、L-肉碱以及亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、法罗培南、厄他培南、多尼培南、比阿培南等碳青霉烯类抗生素［3-5］。

近年来，关于光学纯3-羟基丁酸乙酯的制备研究受到了广泛的关注。本文主要综述了国内外有关光学纯3-羟基丁酸乙酯的制备方法，包括生物拆分法，色谱拆分法，化学不对称还原法，重点介绍2000年之后，生物不对称还原法制备3-羟基丁酸乙酯的研究进展。

1　生物拆分法

生物拆分法主要是利用酶或微生物对对映异构体进行选择性酶解拆分。生物酶本身就是一个手性催化剂，酶的活性中心是一个不对称结构，有利于酶对消旋体的特异性识别，可选择性地作用于外消旋体中的某一对映异构体，从而起到拆分作用。

Fishman等［6］通过固定化的南极假丝酵母脂肪酶B（Candida Antarctica lipase B，CALB）两步酶促拆分（R，S）-EHB得到（S）-EHB和（R）-EHB，且两种对映异构体的化学纯度均达99%，对映体过量值（e.e.值）＞96%，总产率73%（40%（S）-EHB和33%（R）-EHB），其反应式如图1所示。采用分批循环反应体系，循环运转20次，实现千克级规模产品制备，但固定化Candida Antarctica lipase B的价格昂贵，使用量大，成本高。

图1　两步酶法拆分制备（S）-EHB和（R）-EHBFig 1 Synthetic（S）-EHB and（R）-EHB by two-step enzymatic resolution

谷耀华等［7］利用固定化酶PSL/G-NH2-MCF催化 （R，S）-EHB的转酯化拆分反应，转化率为15.6%，（S）-3-羟基丁酸乙酯的e.e.值为17.8%，（R）-3-乙酸基丁酸乙酯的e.e.值为96.2%，对映选择性参数E为61。宣磊等［8］利用巨大芽孢杆菌WZ009酯酶催化（R，S）-EHB水解拆分获得光学纯（R）-EHB，如图2所示，生物催化剂可重复使用5批次。当底物浓度为1%（w/v），0.25 g菌/10 mL，30℃反应2 h，转化率55.5%，e.e.值99%，E值66。微生物酶法拆分条件温和，工艺简单，不易造成环境污染，但成本较高，工业应用上仍受到一定的限制。

图2　酯酶催化不对称水解拆分制备（R）-EHBFig 2 Synthetic（R）-EHB by esterase catalytic asymmetric hydrolytic resolution

2　色谱拆分法

色谱拆分法能够进行简便快速的定性定量分析，也能进行制备规模的分离和微量测定。主要包括薄层色谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、超临界流体色谱法等。具有快速、回收率高、不需要添加手性试剂或其它催化剂等优点，但设备和手性固定相的投入成本较大，流动相的使用消耗量大，溶剂回收利用困难，因而该法局限于实验室规模的制备和对映体纯度的分析。施介华等［9］采用三氟乙酸酐柱前衍生化法在色谱柱Cyclodex B上分离3-羟基丁酸乙酯光学异构体，获得了较好的分离效果，其分离因子（α）和分离度（R）分别为1.02和1.26。向忠权等［10］采用Chiralcel OD-H手性色谱柱作为分离柱，用高效液相色谱法对3-羟基丁酸乙酯对映体进行拆分，以正己烷-异丙醇为流动相，流速1.0 mL/min，柱温25℃时，3-羟基丁酸乙酯对映异构体在11 min内得到分离，分离度（R）达4.25。

3　化学不对称合成法

化学不对称合成技术是有机化学研究领域的热点，该法只需使用少量的催化剂即可将潜手性化合物转化为高立体选择性的手性化合物。化学合成法主要包括不对称氢化反应和不对称氢转移反应，所用的手性催化剂主要是由钯（Pd）、铑（Rh）、钌（Ru）等重金属元素和不同配体形成的络合物。

胡斌等［11］采用钌催化剂RuCl3·3H2O和双膦［CH2PPh2］2为配体的催化剂体系，在高压反应釜中催化乙酰乙酸乙酯（EAA）加氢生成3-羟基丁酸乙酯，且当所用手性四面体簇合物为外消旋体时，反应产物为消旋体；当选用适当的手性配体时，也可得到光学活性的产物。其反应式如图3所示。

图3　不对称氢化反应制备3-羟基丁酸乙酯Fig 3 Synthetic EHB by asymmetric hydrogenation

刘建华等［2］在以CO2（CO）8为催化剂前体，3-羟基吡啶为配体的催化剂体系中，催化环氧丙烷与CO和乙醇发生氢酯化反应，生成 （α）-3-羟基丁酸乙酯和（β）-4-羟基-2-甲基丁酸乙酯两种产物，其反应式如图4所示。

图4　氢酯化反应制备3-羟基丁酸乙酯Fig 4 Synthetic EHB by hydroesterification

Andrew等［12］将100 g的（R）-PHB经过解聚，C-3羟基的甲磺酰化作用和置换作用三步反应获得（S）-EHB，产率为75%，e.e.值为98%。化学不对称合成法的优点在于反应速度快，可获得较高的产率，产物的手性可通过改变配体的手性来修饰；但主要缺点是反应条件比较苛刻，反应步骤繁琐、收率不高、反应所使用的有机溶剂大多有毒，易造成环境污染；而且手性催化剂的制备比较困难，价格昂贵，在产物中容易残留且不易去除，循环使用也困难，因此经济成本高，收益低，从而限制了其工业化的应用进程。

4　生物不对称合成法

生物不对称合成是指利用酶或微生物细胞催化无手性或潜手性的化合物转化为手性化合物的过程。常用的生物催化剂是微生物全细胞，其本质是利用微生物细胞内酶的多样性和立体选择性催化非天然有机化合物的生物转化，可以合成一些化学方法难以实现的手性中间体。利用微生物细胞催化不对称合成具有立体选择性高、反应条件绿色安全、副产物少等优点，生物催化剂通常仅需通过简单的扩增培养获得，特别是进行不对称还原反应时，反应过程中不需要额外添加昂贵的辅因子即可实现辅酶的原位再生［13］。

利用微生物细胞催化乙酰乙酸乙酯（EAA）不对称还原可制备得到光学纯3-羟基丁酸乙酯。目前，可用于不对称还原EAA的生物催化剂来源广泛，包括细菌、酵母、霉菌和植物细胞。2000年之前，利用面包酵母催化EAA不对称还原制备光学纯3-羟基丁酸乙酯的研究报道较多［3］，随后，更多具有催化能力的菌株不断被发现，同时，对菌株性能强化和引入介质工程的研究也逐渐深入。

于平［14］研究了5种酵母催化EAA生成（S）-EHB的能力，筛选出催化性能较好的酿酒酵母菌株，并以其为出发菌株进行紫外诱变筛选得到LY7菌株，150g/L的LY7细胞在水相中可催化250 mmol/L的EAA，产率达84%，e.e.值为94%。于明安［15］利用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）透性化处理啤酒酵母细胞中高活性的脱氢酶，并借助辅助底物乙醇和葡萄糖，水相反应可催化334 mmol/L的EAA不对称还原为（S）-EHB，产率和e.e.值分别为94%和98%。Wolfson等［16］利用固定化酵母细胞IBY在以甘油为介质的反应体系中可将1g底物EAA转化为（S）-EHB，转化率达99%，e.e.值99%。Albuquerque等［17］利用Haploid Saccharomyces cerevisiae W303-1A细胞可在以正己烷为溶剂的有机介质体系中催化39.2 mmol/L 的EAA为 （S）-EHB，产率50%，e.e.值达99%。Yang［18］等筛选了一株原核蓝藻Chlorella vulgaris和一株真核绿藻Paracoccus denitriflcans，可通过光偶联生物催化20mmol/L EAA转化为（S）-EHB，产率分别为70%和 25.2%，e.e.值分别为87.6%和90.2%。Lou所在课题组［19-20］利用固定化细胞Acetobacter sp.CCTCCM209061生物不对称还原EAA为（R）-EHB，在含离子液体体系和含微水有机溶剂体系中反应，催化效率明显提高。

笔者所在实验室也筛选获得了可催化EAA不对称还原为 （R）-EHB的菌株 Pichia membranaefaciens Hansen ZJPH07，并利用紫外诱变和引入含离子液体介质的体系提高其催化效率，经紫外诱变获得的Pichia membranaefaciens-218可催化 350 mmol/L的 EAA，产率 70.8%，e.e.值80.5%［21］，反应体系中添加离子液体 ［BMIM］［BF4］后，可催化550 mmol/L底物EAA还原，产率73%，e.e.值77.8%，相比水相中反应（底物浓度350 mmol/L，产率65.1%，e.e.值68.5%），催化效率和立体选择性均有所提高［22］。

此外，胡向东等［23］将合成（R）-EHB所需的多种酶基因构建于E.coli工程菌中，能将淀粉等可再生碳源转化为（R）-3-羟基丁酸，再与辅助底物乙醇通过酯化反应获得 （R）-EHB，其e.e.值达99.5%。徐忠传等［24］通过15 min/12 mT磁处理后的胡萝卜组织为生物催化剂，可将0.1 g EAA还原为（S）-EHB，产率25%，e.e.值79.9%。综上所述，通过对菌种性能强化和引入介质工程的研究，利用生物不对称还原法制备光学纯3-羟基丁酸乙酯具有良好的应用前景。

5　结论

光学纯3-羟基丁酸乙酯作为具有广泛用途的重要手性中间体，其制备工艺一直受到广泛的关注。手性拆分法反应条件温和，效率高，但应用于工业化制备时成本较高；化学不对称合成法反应快速，但手性催化剂制备困难、价格昂贵；生物不对称还原法具有立体选择性高，副产物少等优点具有良好的工业应用前景。在运用生物不对称还原法制备手性3-羟基丁酸乙酯的研究中，仍存在生物催化剂催化效率不理想，有机溶剂耐受性差等问题，因此，菌种性能的提高和反应体系的优化是其主要研究方向。在今后的研究中，可将构建重组工程菌技术引入该反应，以实现高底物浓度的催化，并获得较高产率；另一方面，也可通过引入介质工程强化生物催化反应过程，如含离子液体介质体系是目前的研究热点，离子液体作为一种绿色溶剂，生物相容性好，细胞毒性小，有望在生物催化反应中发挥优势作用，成为绿色制药工艺的发展方向。

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Research Progress in Preparation Technique of Enantiomeric Pure Ethyl-3-hydroxybutyrate

HOU Jing1，SUN Jing1，HE Jun-yao2，HUANG Jin1，WANG Pu1*
（1.College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou，Zhejiang 310014，China；2.Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo，Zhejiang 315100，China）

Enantiomeric pure ethyl-3-hydroxybutyrate is a versatile and valuable chiral intermediate in pharmaceutical industry.Several preparation methods have been reported so far.In this paper，research process on the production of enantiomeric pure ethyl-3-hydroxybutyrate was summarized，including chiral resolution and asymmetric synthesis，especially the asymmetrically biocatalytic synthesis of optically active ethyl-3-hydroxybutyrate.

enantiomeric pure ethyl-3-hydroxybutyrate；chiral intermediate；resolution；asymmetric synthesis

1006-4184（2016）8-0025-05

2016-02-26

浙江省新苗计划项目（2015R403073），浙江省公益性项目（No.2015C33137），浙江省自然科学基金（LY16B060010）。

侯静（1991-），女，硕士研究生，研究方向：生物制药。E-mail：houjing224@163.com。

王普，女，教授，博士生导师。E-mail：wangpu@zjut.edu.cn。