稳定沉默Beclin1基因的胰腺腺泡细胞株AR42J的建立

李钦芳　吴敏　郭晓榕　李洁　顾晓霞　湛先保



·论著·

稳定沉默Beclin1基因的胰腺腺泡细胞株AR42J的建立

李钦芳吴敏郭晓榕李洁顾晓霞湛先保

目的采用RNA干扰技术沉默大鼠胰腺腺泡细胞AR42J的Beclin1基因表达，构建稳定的Beclin1基因沉默的AR42J细胞系。方法设计并合成3种靶向大鼠Beclin1 mRNA的shRNA及阴性对照shRNA，分别插入质粒GV112，重组质粒分别命名为p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3及p-shRNA-NC。应用lipo3000将重组质粒瞬转入AR42J细胞，应用RT-PCR检测细胞Beclin1 mRNA表达，筛选出沉默效率最高的质粒，在293T细胞内经慢病毒包装(LV-shBeclin1)，感染AR42J细胞，应用嘌呤霉素筛选，采用RT-PCR及蛋白质印迹法分别检测病毒感染细胞Beclin1 mRNA和蛋白表达。结果 重组质粒经琼脂糖凝胶电泳分离及测序证实shRNA序列符合预期。p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3及p-shRNA-NC转染后AR42J细胞Beclin1 mRNA表达抑制率分别为(17.8±4.0)%、(30.6±2.8)%、(45.8±7.7)%、(7.0±11.8)% 。3个p-sh-Beclin1转染细胞的表达抑制率均较未转染细胞显著增加，差异有统计学意义(P值均<0.05)，而转染p-shRNA-NC细胞的表达抑制率与未转染细胞的差异无统计学意义。抑制率最高的p-sh-Beclin1-3经慢病毒包装，感染AR42J细胞，感染细胞的Beclin mRNA表达抑制率为(86.1±1.2)%，蛋白表达抑制率为(87.9±2.8)%，与未感染细胞的差异均有统计学意义(P值均<0.01)。结论成功建立Beclin1基因沉默的AR42J细胞株，为探讨Beclin1基因在急性胰腺炎发病机制中的作用提供新的细胞模型。

胰腺炎；RNA干扰；慢病毒感染；AR42J细胞系；Beclin1基因

Fund program：National Natural Science Foundation of China(81170434)

急性胰腺炎(AP)是胰腺腺泡细胞内酶原颗粒异常活化而致的炎症性改变，目前发病机制尚不明确。Gukovsky等[1]认为，自噬、溶酶体及线粒体功能异常是AP发生的关键因素。自噬属于程序性死亡,是细胞器选择性降解的重要途径，可以促进细胞内营养物质的有效循环利用。蛋白质代谢活跃的胰腺腺泡细胞中生理性自噬水平较高。Beclin1是酵母Atg6在哺乳动物中的同源类似物，广泛存在于细胞中，以胞质为主。它与细胞因子相互作用，通过调节脂质激酶Vps-34蛋白，促进Beclin1-Vps34-Vps15核心复合物形成，从而诱导自噬产生。Beclin1包括N端的BH3结构域、中央的CCD结构域和C端的ECD结构域。Beclin1通过ECD调节细胞自噬功能和发挥抑癌作用；通过BH3与Bcl-2家族成员结合发挥抗凋亡功能；通过ECD和CCD共同与PI3KC3/Vps34相互作用促进细胞凋亡[2]。本研究应用RNA干扰技术沉默胰腺腺泡细胞株AR42J的Beclin1基因表达，为研究Beclin1在AP发病机制中的作用提供新的体外模型。

材料与方法

一、插入靶向Beclin1基因shRNA质粒的构建及鉴定

根据大鼠Beclin1的gene ID:114558及GenBank的NM_001034117信息设计3个靶向Beclin1的shRNA序列：sh-Beclin1-1靶向序列为5′-GGATGGTGTCTCTCGAAGA-3′，起始位点442，GC含量52.63%；sh-Beclin1-2靶向序列为5′-CTCACAGCTCCATTACTTA-3′，起始位点344，GC含量42.11%；sh-Beclin1-3靶向序列为5′-GAGGAGCCATTTATTGAAA-3′，起始位点416，GC含量36.84%。同时设计不针对任何基因的阴性对照shRNA-NC,序列为5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。shRNA均委托上海吉凯基因科技有限公司合成。载体质粒的编号为GV112，元件顺序为hU6-MCS-CMV-Puromycin，含有AgeI、EcoRI酶切位点及嘌呤霉素抗性基因。通过双酶切方法将3个sh-Beclin1及shRNA-NC分别插入质粒GV112，4个重组质粒分别命名为p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3、p-shRNA-NC。质粒经扩增、DNA抽提、琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，并应用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收、纯化，送上海吉凯基因科技有限公司测序。

二、细胞转染及基因沉默效果鉴定

AR42J细胞由本科实验室保存，复苏后常规培养,传代。取对数生长期AR42J细胞，接种于24孔板，每孔2×105个细胞。培养过夜后采用脂质体法将4个重组质粒分别转染AR42J细胞，以未转染质粒的细胞为阴性对照，以孔内只加ddH2O为空白对照。在eppendof试管内分别加入50 μl optiMEM、2 μl助转剂、0.8 μg重组质粒、1 μl lipo3000混均。弃培养过夜的1640培养液，换成350 μl optiMEM培养液，再加入上述混合液，培养8 h，然后换成1640培养液继续培养48 h，收集细胞。采用Trizol提取细胞总RNA，采用RT试剂盒(Takara公司)逆转录成cDNA，采用实时PCR法检测各组细胞Beclin1 mRNA表达。Beclin1引物上游为5′-CACTCTGATCGGGGAGGCAT-3′，下游为5′-TCCAACATCTCCAAACAGCGT-3′，扩增产物215 bp。引物由英骏公司合成，采用聚丙烯凝胶电泳方法纯化。PCR反应条件：95℃ 30 s，95℃ 10 s，60℃ 34 s，40个循环。通过罗氏Lightcycler 480II自带分析软件，经最大二阶导数法的高置信度算法获得Ct值，通过高级相对定量分析法计算细胞Beclin1 mRNA相对表达量。Beclin1 mRNA表达抑制率=1-(转染细胞组Beclin1 mRNA表达量/未转染细胞组Beclin1 mRNA表达量)×100%。实验重复5次，取均值。

三、慢病毒包装及滴度测定

取对数生长期293T细胞，以1×106/孔的密度接种于24孔板，常规培养过夜。第三代慢病毒包装系统(pCMV-VSV-G/pMDLg/pRSV-Rev)由第二军医大学微生物实验室提供。在eppendof试管内分别加入0.222 μg pMDLg、0.166 μg pRSV-Rev、0.166 μg pCMV-VSV-G、0444 μg 抑制效率最高的p-sh-Beclin1，吹打混匀，再加入50 μl optiMEM、2 μl助转剂、1 μl lipo3000，吹打混匀后静置10 mins。将细胞培养液换成350 μl optiMEM，加入上述混合液后培养8 h，更换成DMEM培养液培养12 h，再更换培养液继续培养36 h，收集培养上清，即为包装好的慢病毒(LV-shBeclin1)。采用稀释梯度法检测病毒滴度，并将包装好的慢病毒保存于-80℃冰箱。

四、稳转细胞株建立、筛选及鉴定

取对数生长期的AR42J细胞，以5×105/孔的密度接种于6孔板中，常规培养过夜。弃培养液，加入700 μl 1640培养基、1×108TU/ml的LV-shBeclin1、7 μg/ml聚凝胺，培养24 h，更换培养液继续培养72 h，加入终浓度为2.5 μg/ml的嘌呤霉素(Biosharp公司)筛选5 d。以未感染慢病毒的AR42J细胞作为对照组。收集两组细胞，用Trizol抽提细胞总RNA，采用RT-PCR检测细胞Beclin1 mRNA表达，方法同上。应用Ripa裂解液(上海威奥生物科技有限公司)提取蛋白，采用蛋白质印迹法检测细胞Beclin1蛋白表达，以GAPDH为内参。兔抗人Beclin1抗体购自CST公司，工作浓度1∶1 000；抗GAPDH抗体购自上海威奥生物科技有限公司，工作浓度1∶2 000；山羊抗兔IgG购自CST公司，工作浓度1∶5 000。最后ECL发光，X胶片曝光、显影、定影。应用ImageJ进行灰度值分析。Beclin1蛋白表达抑制率=1-(LV-shBeclin1感染组灰度值/未感染组灰度值)×100%。

五、统计学处理

结　　果

一、shRNA测序及重组质粒鉴定

3个p-sh-Beclin1重组质粒的DNA电泳结果见图1，插入的sh-Beclin1片段大小符合预期。它们的测序结果见图2，序列正确，符合实验要求。

二、靶向Beclin1的shRNA基因沉默效应

p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3、p-shRNA-NC瞬转后AR42J细胞Beclin1 mRNA表达抑制率分别为(17.8±4.0)%、(30.6±2.8)%、(45.8±7.7)%、(7.0±11.8)%。3个p-sh-Beclin1转染细胞的表达抑制率均较未转染细胞显著增加，差异均有统计学意义(t值分别为6.32、15.29、8.40，P值均<0.05)，其中以p-sh-Beclin1-3的表达抑制率最高，而转染p-shRNA-NC的表达抑制率与未转染细胞差异无统计学意义(t=0.84，P>0.05)。

三、稳定的LV-shBeclin1感染的AR42J细胞株鉴定

LV-shBeclin1感染的AR42J细胞Beclin1 mRNA表达抑制率为(86.1±1.2)%，蛋白表达抑制率为(87.9±2.8)%(图3)，与未感染细胞的差异均有统计学意义(t值分别为98.98、44.39,P值均<0.01)， 提示稳定的Beclin1基因沉默的AR42细胞系构建成功。

注：1：空白对照；2：阴性对照；3：Mark

图2　p-sh-Beclin1-1(2A)、p-sh-Beclin1-2(2B)、p-sh-Beclin1-3(2C)重组质粒测序图

图3　未感染细胞(1)、LV-sh-Beclin1感染AR42J细胞(2)Beclin1蛋白表达

目前为止，人们对AP发病机制的了解还处于探索阶段。通过对多种小鼠模型的观察发现AP中存在自噬受损，而溶酶体功能障碍就是其原因之一。Gukovskaya等[3]提出，溶酶体或自噬功能障碍在AP中发挥重要作用，甚至是多种降解途径的共同通路。因此，自噬的探讨对阐明AP的发病机制至关重要，也为疾病的预防及治疗奠定基础。Beclin1是自噬相关基因，参与自噬体的形成，在基础研究中常常作为自噬的标志物反映自噬的水平。AR42J细胞源于大鼠胰腺外分泌部的种植性肿瘤，在裸鼠中具有成瘤性，是目前唯一的在培养状态下具有正常胰腺腺泡细胞各种特性的细胞系，被广泛地用于胰腺外分泌部的体外研究，包括钙离子通路的研究、炎症的研究等。本研究通过RNA干扰技术沉默AR42J细胞Beclin1基因表达，构建稳定的Beclin1基因沉默的AR42J细胞株，为探讨自噬在AP发病机制中的作用提供细胞模型。

RNA干扰(iRNA)是内外源双链RNA在转录水平抑制基因表达的一种生物学机制，于1998年首次在线虫中发现，是目前在多数基础研究领域沉默基因表达、了解基因功能的经典方法[4]。iRNA主要分为3种途径，其中以shRNA途径沉默效果最为稳定，广泛应用于哺乳动物细胞。shRNA是化学合成的具有单链环结构的双链RNA，它以质粒或病毒为载体进入细胞内，在Dicer作用下分解成21～23 nt的siRNA，siRNA与RISC特异性结合降解靶mRNA，进而沉默靶基因的表达[5]。

本研究合成3种靶向大鼠Beclin1 mRNA的shRNA,构建重组质粒，转染AR42J细胞，采用RT-PCR方法筛选具有最佳沉默效果的执行质粒，再进行慢病毒包装。本研究采用的第三代慢病毒包装系统有很多优势。首先产生RCV的可能性降低，其次扩大了宿主细胞范围，且形成的慢病毒颗粒更加稳定，容易离心浓缩成高滴度病毒，再次可以大幅度地减少病毒复制的可能性，提高生物安全性[6]。聚凝胺通过降低病毒和细胞表面之间的电荷排斥促进病毒进入细胞内，从而提高转染效率[7]。将慢病毒感染AR42J细胞后，通过嘌呤霉素的反复筛选，最后获得稳定的Beclin1基因表达抑制率高达86%的AR42J细胞株，为探索Beclin1与AP的关系提供了全方位可操作的细胞模型。

[1]Gukovsky I, Pandol SJ, Mareninova OA, et al. Impaired autophagy and organellar dysfunction in pancreatitis[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2012,27(Suppl 2):27-32.

[2]Kang R, Zeh HJ, Lotze MT, et al. The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis[J]. Cell Death Differ, 2011,18(4):571-580.

[3]Gukovskaya AS, Gukovsky I. Autophagy and pancreatitis[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2012,303(9):G993-G1003.

[4]Ortiz-Quintero B. RNA interference: from origins to a novel tool for gene silencing[J]. Rev Invest Clin, 2009,(61):412-427.

[5]Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, et al. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells[J]. Genes Dev, 2002,(16):948-958.

[6]张磊,刘庆友,胡天，等.第三代慢病毒高效率包装系统的建立[J].基因组学与应用生物学, 2009,(28):326-330.DOI:10.3969/gab.028.000326.

[7]吴敏,李洁,刘晓，等.稳定表达EGFP-LC3的AR42J细胞系的建立[J].中华胰腺病杂志, 2015,(15):112-115.DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.02.011

(本文编辑：屠振兴)

Establishment of pancreatic acinar cell line AR42J with stable knockdown of Beclin1

LiQinfang,WuMin,GuoXiaorong,LiJie,GuXiaoxia,ZhanXianbao.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:ZhanXianbao,Email:zhanxianbao@126.com

ObjectiveTo silence the beclin1 gene expression by using RNA interference technology in AR42J rat pancreatic acinar cells, and build a stable AR42J line silencing beclin1. MethodsThree kinds of shRNA targeting rat beclin1 mRNA and negative control shRNA were designed and synthesized, and were inserted into the plasmids GV112, respectively. The recombinant plasmids were named asp-sh-Beclin1-1,p-sh-Beclin1-2,p-sh-Beclin1-3 andp-shRNA-NC. Lipo3000 was used to transfect the recombinant plasmid into AR42J cells, the expression of beclin1 mRNA were detected by RT-PCR to screen for the most efficient silencing plasmid, and then it was packaged into lentiviral(LV). AR42J cells were infected with LV and screened by puromycin. Beclin1 mRNA and protein expression was determined by RT-PCR and Western blot. ResultsThe recombinant plasmid was confirmed by agarose gel electrophoresis and sequencing showed that shRNA sequences were in line with expectations. The beclin1 mRNA inhibition rates of AR42J cells afterp-sh-Beclin1-1,p-sh-Beclin1-2,p-sh-Beclin1-3 andp-shRNA-NC transfection were (17.8±4.0)%, (30.6±2.8)%, (45.8±7.7)%, (7.0±11.8)%, respectively. The inhibition rates of threep-sh-Beclin1 transfection cells were significantly higher than that in non-transfection cells, and the difference was statistically significant (P<0.05). While the inhibition rate ofp-shRNA-NC transfection cells was not significantly different from that of non-transfection cells.p-sh-Beclin 1-3 with highest rate of inhibition was packaged by LV, and infected AR42J cells, then puromycin was applied to screen, inhibition rate of beclin mRNA expression in LV infection cells was (86.1±1.2)%, and the protein expression inhibition rate was (87.9±2.8)%, and the difference between infection and non-infection groups was statistically significant (P<0.05). ConclusionsThe stable AR42J line silencing beclin1 is successfully established, which can provide a new cell model for future research of the role of beclin1 in the pathogenesis of acute pancreatitis.

Pancreatitis;RNA interference;Leativirus infections;AR42J cell line;Beclinl genes

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.01.006

200433上海，第二军医大学长海医院消化科

湛先保，Email: zhanxianbao@126.com

国家自然科学基金(81170434)

2015-11-16)