芍药苷对UVB所致HaCaT细胞凋亡的防护作用

杨秀华　陈宏泉

论 著

芍药苷对UVB所致HaCaT细胞凋亡的防护作用

杨秀华陈宏泉

目的： 明确芍药苷对UVB所致HaCaT细胞凋亡的防护作用。方法： 将HaCaT细胞分为8组，A组:空白对照组；B组:UVB照射对照组；C～H组分别为0.25 mg/L，0.5 mg/L，1 mg/L，2.5 mg/L，5 mg/L及10 mg/L芍药苷预处理组，均照射UVB。用流式细胞术检测细胞凋亡情况，RT-PCR检测P21mRNA的表达水平。结果： B组细胞凋亡率为4.840±0.836明显高于C～G组（0.423±0.179、1.127 ±0.535、1.633±0.417、2.570±0.439、3.137±0.347）（P＜0.05）。B组与H组（4.203±0.655）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；B组P21mRNA表达为1.040±0.007明显高于C～H组（0.440±0.015、0.551±0.013、0.857±0.017、0.848±0.027、0.850±0.052、0.923±0.035）（P＜0.05）。结论： 芍药苷在一定浓度内（0.25～5 mg/L）对UVB致HaCaT细胞的凋亡有保护作用，并能减少P21mRNA的表达。

芍药苷； 中波紫外线； HaCaT细胞

中波紫外线（UVB）是引起皮肤光损伤的主要因素［1］，可引起细胞DNA损伤、氧化应激、细胞凋亡，从而导致皮肤光损伤。光损伤时光产物本身及经典的DNA双链的断裂（DSB）均可通过活化分子警察P53，激活下游信号蛋白P21等细胞周期激酶抑制剂［2］。P21作为P53基因下游的细胞周期调控因子，在细胞周期、DNA修复及细胞凋亡方面起着重要作用［3，4］。

研究发现芍药苷具有清除组织细胞内自由基、抗氧化损伤等特点［5］，还具有保护损伤细胞、抑制细胞凋亡［6］等作用。HaCaT细胞的生物学特征与正常人角质形成细胞相似，本项研究采用UVB照射HaCaT细胞以建立细胞凋亡模型，以芍药苷为光防护剂，检测芍药苷对UVB所致HaCaT细胞光损伤过程中细胞凋亡、P21mRNA表达的影响，以探讨芍药苷的光防护作用。

1　材料与方法

1.1材料与仪器 95%芍药苷由宁波立华制药惠赠，HaCaT细胞株由韩国延世大学丁擘晓博士授权，青岛大学医学院王春波教授惠赠，UVB型紫外辐照计购自北京师范大学光电仪器厂。

1.2 方法

1.2.1实验分组 将HaCaT细胞分为8组。A组:空白对照组，不加芍药苷，不照射UVB；B组:UVB照射组，不加芍药苷；C组:0.25 mg/L芍药苷组；D组:0.5 mg/L芍药苷组；E组:1 mg/L芍药苷组；F组:2.5 mg/ L芍药苷组；G组:5 mg/L芍药苷组；H组:10 mg/L芍药苷组；C～H组均照射UVB。

1.2.2HaCaT细胞培养 HaCaT细胞用10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM-1640培养基，在37℃、体积分数为5%CO2的细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于试验。

1.2.3照射方法 待HaCaT细胞贴壁生长至80%左右融合时，从细胞培养箱中取出，无菌条件下加入不同浓度芍药苷。空白对照组和照射对照组只加角质形成细胞专用培养基使各孔的终体积相等。细胞放入37℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱中孵育24 h后，除空白对照组外，其余组均照射UVB，照射剂量为20 mJ/cm2，照射垂直距离为10 cm。

1.2.4细胞凋亡检测 细胞经不同浓度芍药苷处理UVB照射18 h后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。用PBS洗涤，离心收集细胞（1000 r/min，5 min），弃上清，用缓冲液重新悬浮细胞，细胞计数后将浓度调整到1×106个/mL，按照Annenxin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书操作规程检测细胞凋亡率。用专用Cell Quest软件将所得数据采进行收集、储存和分析各组HaCaT细胞的凋亡率。

1.2.5P21mRNA表达量 细胞经不同浓度芍药苷处理并接受 UVB照射18 h后，用RT-PCR法检测P21mRNA表达量，凝胶成像系统分析目的条带P21/ GAPDH的灰度比值并进行统计分析。P21及GAPDH引物序列、反应条件、扩增产物分子量见表1。

1.3统计学方法 应用SPSS 17.0软件，实验结果表示为¯x±s，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用小样本LSD检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1芍药苷对UVB照射后HaCaT细胞凋亡率的影响 芍药苷对UVB照射后HaCaT细胞凋亡率的影响分析见图1表2。C～G组的HaCaT细胞凋亡率明显低于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；各实验组间，C～E组间的凋亡率较F～H组低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1　内参和GAPDH P21的引物序列

图1　1a～h:A～H组HaCaT细胞凋亡结果

2.2芍药苷对UVB照射后HaCaT细胞P21mRNA表达的影响 各组均有P21mRNA的表达，GAPDH对照均出现明显扩增条带，表明各组细胞中RNA的质量及RT-PCR过程均良好，各组P21/GAPDH相对表达量见图2表2。B组HaCaT细胞P21mRNA表达量最高，与B组比较各实验组HaCaT细胞P21mRNA表达量明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表2　芍药苷对UVB照射后HaCaT细胞凋亡率及P21mRNA表达量的影响

表2　芍药苷对UVB照射后HaCaT细胞凋亡率及P21mRNA表达量的影响

组别　　凋亡率（%）　P21mRNA表达量A组　0.047±0.015　0.584±0.023 B组　4.840±0.836　1.040±0.007 C组　0.423±0.179　0.440±0.015 D组　1.127±0.535　0.551±0.013 E组　1.633±0.417　0.857±0.017 F组　2.570±0.439　0.848±0.027 G组　3.137±0.347　0.850±0.052 H组　4.203±0.655　0.923±0.035

图2　a:GAPDH在各组的表达；b:P21mRNA在各组的表达

3　讨论

近年来，由于大气中的臭氧层破坏，致地球表面UVB辐射强度逐年增加，UVB可引起DNA损伤、氧化应激、免疫抑制、细胞凋亡等［7，8］。因此对UVB的防护成为人们关注的重要课题。细胞周期是在周期调控因子（p21、p53等）调节下进行的严密有序的过程，分为S期（DNA合成期）、M期（有丝分裂期）以及把S期、M期分开的G1期（DNA合成前期）、G2期（DNA合成后期）。当表皮细胞受到UVB刺激时发生DNA突变，p53基因首先被激活，p53蛋白表达增加，活化细胞周期蛋白激酶抑制物p21的转录，抑制周期蛋白激酶的活性，使细胞周期停滞于G1期，以便修复受损DNA［9］。有学者认为细胞周期阻滞是一种细胞自我保护性的机制［10］。

本实验结果显示，与空白对照组比较，照射对照组 HaCaT细胞凋亡率明显增加，HaCaT细胞P21mRNA表达量明显增加，表明UVB照射HaCaT细胞后可致细胞凋亡率、P21mRNA表达量增加。相对于照射对照组，C～G组细胞凋亡率明显减少，C～H组P21mRNA表达明显减少，综合两组数据发现:芍药苷在0.25～5 mg/L浓度内可减少P21mRNA的表达量，降低UVB所致HaCaT细胞的凋亡率。我们推测芍药苷的抗凋亡作用可能与降低 UVB所致P21mRNA的表达有关。以往的相关研究表明，芍药苷对氧化损伤具有保护作用。张洪英等［11］通过研究证实，白芍总苷（芍药苷为白芍总苷的主要有效成分）在低浓度（0.5 mg/L和2.5 mg/L）时对HaCaT细胞增值有促进作用，本实验的结论与此相类似。据此我们推测，芍药苷在低浓度时可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，发挥其光防护作用。

综上所述，我们认为芍药苷在一定浓度范围内（0.25～5 mg/L）对UVB致HaCaT凋亡有防护作用，其作用机制可能与降低HaCaT细胞P21mRNA的表达水平有关。

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（收稿:2015-09-11 修回:2015-10-09）

Protective effects of Paeoniflorin on HaCaT cell aPoPtosis induced by UVB

YANG Xiuhua，CHEN Hongquan.

Department of Dermatology，the Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，China Corresponding author:CHEN Hongquan，E-mail:chhq6198@163.com

Objective:To determine the protective effects of paeoniflorin on HaCaT cells apoptosis induced by UVB.Methods:HaCaT cells were divided into eight groups（from group A to group H）.HaCaT cells in group A was used as control.Those in group B were treated with UVB irradiation only and those in group C-H were treated with different dose（0.25 mg/L，0.5 mg/L，1 mg/L，2.5 mg/L，5 mg/L and 10 mg/L）of paeoniflorin and UVB.The apoptosis was detected by the flow cytometry assay.The expression level of P21mRNA was detected by RT-PCR.Results:The apoptosis rate of HaCaT cells in group B was 4.840±0.836，which was higher than those in group C-G（0.423±0.179，1.127±0.535，1.633±0.417，2.570±0.439，3.137± 0.347，respectively）（P＜0.05）.There was no significant difference in the apoptosis rate of HaCaT cells between group B and group H（P＞0.05）.The expression of P21mRNA in the group B was 1.040±0.007，which was higher than those in group C-H（0.440±0.015，0.551±0.013，0.857±0.017，0.848±0.027，0.850± 0.052，0.923±0.035，respectively）（P＜0.05）.Conclusion:Paeoniflorin has a protective effect on the apoptosis of HaCaT cells induced by UVB，and reduces the expression of P21mRNA of HaCaT cells at a certain concentration（0.25-5 mg/L）.

paeoniflorin；UVB；HaCaT cell

山东省中医药科技发展计划项目（编号:2011-219）

青岛大学附属医院皮肤科，青岛，266003

陈宏泉，E-mail:chhq6198@163.com