正交试验法优选增率复脉颗粒水提工艺

张大军，张晓华，王兆华

(吉林省中医药科学院，吉林 长春 130012)

正交试验法优选增率复脉颗粒水提工艺

张大军*，张晓华，王兆华

(吉林省中医药科学院，吉林 长春 130012)

确定增率复脉颗粒的最佳水提工艺。方法：应用高效液相色谱法和正交实验法，以增率复脉方中活性成分丹参素转移率及全方干膏得率为指标，确定增率复脉颗粒的最佳水提工艺参数。结果：增率复脉颗粒最佳水提工艺为：处方饮片加10倍量水，煎煮2次，每次2h。结论：经试验优选出的水提工艺稳定可靠，适用于增率复脉颗粒的提取。

增率复脉颗粒；HPLC法；正交实验法；丹参素

增率复脉颗粒由丹参、黄芪、桂枝等八味中药组成，是吉林省中医药科学院内科应用于临床多年的经验方。用于治疗病态窦房结综合症(心动过缓)，可明显增加病人心率，延缓疾病进展[1]。经吉林省中医药科学院药理室试验研究表明：灌胃增率复脉颗粒(0.25～2g/kg)可明显抑制普萘洛尔引起的大鼠心率减慢作用；缩短乙酰胆碱引起的大鼠心动过缓的持续时间；能明显延长异丙肾上腺素和亚硝酸钠耐常压缺氧存活时间；对正常小鼠，亦可明显延长小鼠耐常压缺氧死亡时间[2]。本实验以方中活性成分丹参素转移率和全方干膏得率为指标，采用HPLC法和正交实验法，确定了该制剂最佳水提工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器

日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SPD-10A紫外检测器(日本岛津公司)；AE163电子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 试药

丹参素钠对照品(批号110855-2014)购自中国药品生物制品检定研究院；乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯，乙酸乙酯、冰乙酸、氯化钠为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交实验设计[3]

以活性成分丹参素转移率和全方干膏得率为指标，选用L9(34)正交表对加水量、提取时间、提取次数进行考察。因素和水平见表1，试验顺序见表2。

表1 因素和水平表

2.2 样品测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm,4.6×250mm)；流动相：乙腈-0.5%乙酸(2：98)；流速：1mL/min，检测波长：283nm；柱温：室温。

2.2.2 样品溶液的制备

按处方比例称取各药材饮片，按表2条件进行提取，合并提取液，滤过，滤液浓缩并定容至250mL，得到9份样品溶液。

2.2.3 对照品溶液的制备

精密称取丹参素钠对照品适量，加50%甲醇制成每1mL含1.2mg的溶液(相当于每1mL含丹参素1.08mg)，即得。

2.2.4 供试品溶液制备与测定

精密吸取“2.2.2”项下九份样品溶液各50mL，分别加盐酸2d，再加入氯化钠5g，摇匀，滤过，吸取滤液各25 mL，用乙酸乙酯提取4次，每次20 mL，合并提取液，回收溶剂至近干，残渣以50%甲醇溶解，并定容至10 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，按“2.2.1”项下条件，测定并计算丹参素含量及提取率；精密吸取剩余样品溶液各90mL，平行2份，水浴蒸干，于105℃烘箱干燥至恒重，测定干燥物重量，计算干膏得率，测定结果见表2。

2.2.5 阴性供试品溶液制备

精密吸取缺丹参的阴性样品溶液 50mL，按供试品溶液制备方法制备阴性供试品溶液。

2.2.6 专属性试验

精密吸取上述对照品溶液、阴性供试品溶液和供试品溶液各 10 μL，按"2.2.1"项下的色谱条件进样。结果表明，供试品溶液中主要色谱峰得以充分分离，且丹参素峰形良好，阴性对照在丹参素保留时间处无干扰峰出现，见图 1。

2.2.5 方法学考察

丹参素在23.8～238μg·mL-1范围内呈现良好的线性关系，回归方程为Y=332723.8x+3645.5，r=0.9998；取丹参素钠对照品溶液重复进样6次，RSD=0.35%、吸取供试品溶液重复进样6次，RSD=0.58%，结果高效液相色谱仪精密度良好；分别取供试品溶液，于24h内不同时间重复进样6次，RSD=0.93%，表明供试品溶液在24h内稳定。

A.丹参素对照品色谱图；B.供试品色谱图；C阴性对照色谱图

图1 高效液相色谱图

2.3 结果

2.3.1 正交实验评分

根据丹参素转移率和干膏收率，将两指标综合加权评分。分别将丹参素转移率、干膏得率最高结果计为100，并与之比较，依次对9次试验结果进行综合评分。将丹参素提取率权重系数设为0.7，将干膏得率权重系数设为0.3，综合评分=0.7×丹参素转移率+0.3×干膏得率,结果见表2。

2.3.2 方差分析见表3

表2 正交实验设计及结果分析

从试验结果直观得出，各因素影响顺序为C(煎煮次数)>B(煎煮时间)>A(加水量)；从方差分析结果得出，C(煎煮次数)P<0.05，具有显著性，B(煎煮时间)和A(加水量)不具有显著性。从生产的实际考察，为了节省工时，节省能源，优选煎煮工艺为A2B3C2，即加10倍量水，煎煮2次，每次2h。

表3 方差分析表

注：F0.05=19.00 F0.01=99.00；“*”表示有显著性

2.4 工艺验证实验

分别称取50倍量处方药材，共3份，按照确定的优选工艺条件A2B3C2进行重复验证，测定结果见表4。

表4 工艺验证实验结果

2.5 结论

通过正交实验优选和工艺验证，确定了增率复脉颗粒水煮最佳工艺参数为：处方药材加10倍量水，煎煮2次，每次2h。在此工艺条件进行3次工艺验证试验，丹参素转移率在60%以上，RSD=1.26%，表明该最佳工艺条件是稳定可靠，可用于增率复脉颗粒工艺提取。

3 讨论

(1)采用高效液相色谱法测定丹参素含量的文献报导较多[5-6]，我们曾采用甲醇-冰乙酸-水(5：1：94)、甲醇-0.1%磷酸(10：90)等多种流动相进行分离，供试品中丹参素色谱峰未能得到充分分离；后采用乙腈酸水系流动相试验，经多次摸索，供试品中丹参素色谱峰得以充分分离，最后确定流动相为：乙腈-0.5%乙酸(2：98)。

(2)曾采用Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,4.6×150mm)色谱柱进行试验，发现丹参素色谱峰与后面杂质峰未能达到充分分离，选用Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,4.6×250mm)色谱柱，供试品中丹参素色谱峰得以充分分离。

(3) 供试品溶液制备过程中滴加盐酸，可提高乙酸乙酯萃取效果；加氯化钠可减少乳化。

[1] 钱 峰，于清华，张晓华，等.于作盈教授治疗病态窦房结综合征经验[J].中国中医急症，2013，22 (10)：1711-1729.

[2] 增率复脉颗粒药效试验，本项目研究资料待发表.

[3] 江玲丽，程建明.正交试验优选宣肺化痰方水提工艺[J].现代中药研究与实践，2015，29(5):43-45.

[4] 李全斌，张昌文，吴建萍，等.活血定痛合剂中丹参素和原儿茶醛的含量测定[J].实用药物与临床，2014，17(9)：1170-1174.

[5] 李芸荟.HPLC法测定冠心宁软胶囊中丹参素的含量[J].天津药学，2015，27(3)：16-17.

[6] 杨炳火，夏崇才，周芙琼，等.正交实验设计优化超声煎煮法提取丹参中丹参素的研究[J].环球中医药，2014，7(12)：926-928.

(本文文献格式：张大军，张晓华，王兆华.正交试验法优选增率复脉颗粒水提工艺[J].山东化工，2016，45(12)：28-30.)

Optimization of Extraction Techenology of Zengmaifulv Granules by Orthogonal Test

Zhang Dajun*,Zhang Xiaohua,Wang Zaohua

(Academy of Chinese Medical Sciences of Jilin Province, Changchun 130012,China)

Objective：To establish the best decoction technology of Zengmaifulv granules .Methods：Take transport rate of Danshensu and extractive of Chinese herbal decoction pieces as an indecator to determine the extraction process of Zengmaifulv granules. Results：Herbs plus 10 times amount of water to decoct 2times,boiling 2hours every time. Conclusion： The optinized techenology is stable and reliable, can be used tor the extraction of Zengmaifulv granules.

zengmaifulv granules; orthogonal test; HPLC; danshensu

2016-04-18

吉林省中医药专题研究项目(20152T22)

张大军(1964—)，主任药师，研究方向：中药新药与制剂。

TQ461

A

1008-021X(2016)12-0028-03