消渴通痹颗粒对糖尿病大鼠下肢缺血肌组织HIF-1α和VEGF表达的影响

张效科，袁有才，邓　翀，李　瑶，刘　梦

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)



论著

消渴通痹颗粒对糖尿病大鼠下肢缺血肌组织HIF-1α和VEGF表达的影响

张效科，袁有才，邓翀，李瑶，刘梦

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

目的观察消渴通痹颗粒对糖尿病大鼠下肢缺血肌组织缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响。方法取SD大鼠60只，随机取10只作为空白组，其余大鼠采用高脂饮食复合链脲佐菌素、股动脉结扎法建立糖尿病大鼠下肢缺血模型。将造模成功大鼠随机分为模型组，消渴通痹颗粒大、中、小剂量组及西医药组，空白组及模型组给予生理盐水10 mL/(kg·d)灌胃，消渴通痹颗粒大、中、小剂量组分别给予消渴通痹颗粒1.875 g/(kg·d)、1.35 g/(kg·d)、0.625 g/(kg·d)灌胃，西药组给予西洛他唑45 mg/(kg·d)灌胃，连续灌胃6周。观察大鼠一般情况及体质量、血糖变化，取缺血侧肌肉采用实时定量PCR法检测HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表达情况。结果消渴通痹颗粒大、中、小剂量组灌胃6周后大鼠体质量均明显高于模型组(P均<0.05)，且消渴通痹颗粒中剂量组大鼠体质量明显高于消渴通痹颗粒大、小剂量组(P均<0.05)；消渴通痹颗粒中剂量组血糖水平明显低于模型组及其他给药组(P均<0.05)。模型组HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表达量均明显高于空白组(P均<0.05)，各给药组HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，且消渴通痹颗粒中剂量组HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表达量均明显低于消渴通痹颗粒大剂量组(P均<0.05)。结论消渴通痹颗粒可通过增加缺血部位肌肉组织中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表达而促进缺血组织新生血管形成，改善糖尿病肢体缺血状态。

糖尿病；消渴通痹颗粒；HIF-1αmRNA；VEGFmRNA

糖尿病下肢缺血病变是糖尿病最常见的慢性并发症之一，包括周围神经、血管及肌肉组织损害，其发病与肢体微血管病变导致的低灌注有密切关系，所以改善肢体的微循环是防治的主要方法[1-2]。除传统的降糖、降脂、扩张血管、营养神经等治疗外，血运重建是治疗的关键，血管新生促进侧支循环建立，替代损伤的微血管是潜在的方向。本实验在前期研究的基础上，采用高脂饮食复合链脲佐菌素 (STZ)、股动脉结扎法建立糖尿病大鼠下肢缺血模型，观察了消渴通痹颗粒对糖尿病下肢缺血病变大鼠缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响，现将结果报道如下。

1　实验资料

1.1实验动物清洁级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量(200±20)g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供，合格证号：SCXK(陕)2012-003。

1.2药物与试剂消渴通痹颗粒(黄芪、当归、葛根、桑白皮、威灵仙、祖师麻)由陕西中医学院附属医院制剂室提供，每克相当于原药4.95 g；西洛他唑片，浙江大冢制药有限公司生产，50 mg/片，国药准字H10960014； STZ，美国Sigma公司；TRIzol Reagent(Invitrogen 公司)，批号：14105；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time(DRR037A)(TaKaRa Biotechnology Co.Ltd公司)，批号：BK1301；SYBY Premix Ex TaqTM Ⅱ[Perfect Real Time(DRR081A)(TaKaRa Biotechnology Co.Ltd公司)]，批号：AK2503。引物合成由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成， GAPDH：Forward TAC CCA CGG CAA GTT CAA CG，Reverse CAC CAG CAT CAC CCC ATT TG；HIF-1a：Forward AGA GTT ACC TGC CCT GTC CT，Reverse AGT AGC AGT GGC TGT GGT TC；VEGF：ForwarTAT CTT CAA GCC GTC CTG TG，Reverse CTC CTA TGT GCT GGC TTT GG。实时定量PCR仪，BIO-RAD公司IO5TM Multicolor Real-Time PCR Detection System；RNA定量仪，美国Nano Drop ND-1000 spectrophotometer。

1.3实验方法大鼠于自然光线、自由饮水摄食条件下适应性喂养1周。随机选择10只作为空白组，喂饲普通饲料。其余大鼠喂饲高脂饲料，高脂饲料配方为:普通饲料70%、动物油15%、胆固醇5%、蔗糖10%,制成块料,烤干备用,每次配1周的用量。高脂饲料喂养1个月后，禁食12 h后，用0.1%枸橼酸缓冲液(pH 4.2，4 ℃)将STZ配成1%浓度，45 mg/kg左下腹腔单次注射，72 h后尾静脉采血，拜耳血糖仪测定血糖，血糖≥16.7 mmol/L为造模成功，3 d后再次尾静脉采血测血糖达标者进入下一造模环节。取糖尿病成模大鼠以10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔麻醉，切开左股内侧皮肤，分离股动静脉，在坐骨神经分三叉处，用丝线永久结扎股动静脉，缝合切口，制成单侧肢体缺血模型[3]，术后常规伤口涂红霉素，注射青霉素预防感染。将造模成功的大鼠随机分为模型组8只、消渴通痹颗粒大剂量组9只、消渴通痹颗粒中剂量组9只、消渴通痹颗粒小剂量组8只和西药组8只。空白组及模型组给予生理盐水10 mL/(kg·d)灌胃，消渴通痹颗粒大、中、小剂量组分别给予消渴通痹颗粒1.875 g/(kg·d)(相当于成人每千克体质量用药量的15倍，成人按60 kg计)、1.35 g/(kg·d)、0.625 g/(kg·d)灌胃，西药组给予西洛他唑45 mg/(kg·d)(相当于成人每千克体质量用药量的15倍)灌胃，均1次/d。每2周根据大鼠体质量变化调整给药剂量，实验中大鼠全部不限制饮水与饮食，不给予其他药物治疗，连续灌胃6周。

1.4观察指标

1.4.1一般指标观察造模前后及灌胃后大鼠一般状态(精神、毛发、色泽)、饮水及摄食量、体质量、血糖变化情况。

1.4.2肌肉组织的采集实验结束后，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，从左下肢手术造模部位下端取1小块肌肉组织，迅速分为4份放入冷冻管入液氮冻存，标本采集结束后移至-80 ℃冰箱备用。

1.4.3下肢肌肉组织中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表达检测采用实时定量PCR法检测。取-80 ℃保存的肌肉组织100 mg，Trizol法抽提总RNA，RNA定量后Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time(DRR037A)反转录试剂盒逆转录合成cDNA。采用SYBY Premix Ex TaqTM Ⅱ[Perfect Real Time(DRR081A)]试剂盒检测。25 μL反应体系，反应条件: 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环反应40次，PCR反应结束后，将PCR反应液温度自60 ℃缓慢升温至95 ℃，实时监测SYBR GreenⅠ的荧光信号强度变化，获取溶解曲线，以确认PCR反应的特异性。反应结束后获取循环阈值(CT值)，对拷贝数以10为底取对数作为横坐标，CT值为纵坐标，采用Excel软件绘制标准曲线，进行实验数据分析。

2　结　　果

2.1各组大鼠一般情况及体质量、血糖变化情况各造模组大鼠高脂喂养后体质量明显增加，链脲佐菌素腹腔注射后大鼠多尿、多饮、消瘦明显，血糖明显升高，股动脉结扎后下肢缺血明显。消渴通痹颗粒大、中、小剂量组灌胃6周后大鼠体质量均明显高于模型组(P均<0.05)，且消渴通痹颗粒中剂量组大鼠体质量明显高于消渴通痹颗粒大、小剂量组(P均<0.05)；消渴通痹颗粒中剂量组血糖水平明显低于模型组及其他给药组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠干预后体质量及血糖情况±s)

注:①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与消渴通痹颗粒中剂量组比较，P<0.05。

2.2各组大鼠下肢肌组织中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表达情况模型组HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表达量均明显高于空白组(P均<0.05)，各给药组HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，且消渴通痹颗粒中剂量组HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表达量均明显低于消渴通痹颗粒大组(P均<0.05)。见表2。

表2　各组大鼠下肢肌肉组织中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表达情况

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与消渴通痹颗粒中剂量组比较，P<0.05。

3　讨　　论

微血管病变是糖尿病周围神经病变、下肢动脉病变、糖尿病足及糖尿病肌病的主要发病学说之一，该学说认为微血管病变所致神经肌肉组织灌注不足而致其缺氧缺血导致病理损害以致出现临床症状。组织缺氧缺血在糖尿病发病早期即存在[4]，而HIF-1α是调节细胞内氧代谢的关键因子之一，在低氧状态下能够稳定存在，而在常氧状态下迅速降解,其调控缺氧引起的血管新生、细胞凋亡等多种细胞适应性反应[5]，在血管新生信号的产生中起到关键作用，其通过调控下游VEGF基因编码转录发挥作用[6]，并可以在骨髓动员内皮细胞祖细胞中进行内皮重塑[7],从而形成成熟的新生血管[8]。

消渴通痹颗粒是陕西中医药大学治疗糖尿病周围神经病变的专利药物，由黄芪、当归、葛根、桑白皮、威灵仙、祖师麻组成，具有益气活血、通络止痛的作用，前期的研究显示该方能促使糖尿病大鼠新生血管的生成，减轻髓鞘损伤等[9-10]。本实验在前期基础上增加了高脂喂养造模，有利于形成肥胖及胰岛素抵抗，更接近临床改变。实验发现糖尿病周围神经病变支配区域的肌肉组织处在缺氧缺血状态，肌肉组织中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表达均显著上升，中药消渴通痹颗粒中剂量可显著下调肌肉组织中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA的表达。由此推测消渴通痹颗粒可通过增加缺血部位肌肉组织中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表达而促进缺血组织新生血管形成，改善糖尿病肢体缺血状态。

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[3]冯树行，杜军，吴晓青，等. 大鼠缺血性周围神经病的实验模型制作[J]. 沈阳部队医药，2006,6(4):240-242

[4]郑全林，徐向进. 缺氧诱导因子-1与糖尿病慢性血管并发症[J]. 实用医学杂志，2009，25(4)：671-672

[5]艾丽根，刘芳. 缺氧诱导因子-1α与糖尿病血管新生的研究进展[J]. 中国糖尿病杂志，2015，23(5)：470-474

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[10] 张效科，陈伟铭，袁有才，等. 消渴通痹颗粒对糖尿病大鼠坐骨神经分子免疫及血清炎症因子的影响[J]. 时珍国医国药，2015，26(2)：267-269

Effects of Xiaoke Tongbi Granule on the expression of HIF-1α and VEGF in ischemia tissue of lower limb muscle of diabetic rats

ZHANG Xiaoke, YUAN Youcai, DENG Chong, LI Yao, LIU Meng

(Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, Shaanxi, China)

Objective It is to observe the effects of Xiaoke Tongbi Granule on the expression of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in ischemia tissue of lower limb muscle of diabetic rats. Methods 10 SD rats were randomly selected as the blank control group, and the other rats were established by high fat diet, STZ and femoral artery ligation was used to establish the model of the lower limb ischemia in diabetic rats. successful model rats were randomly divided into model group, large, medium and small dose groups for Xiaoke tongbi granule, and western medicine group, blank control group and model group were given normal saline 10 mL/(kg·d), XiaoKe Tongbi Granules of large, medium and small dose groups were treated with Xiaoke Tongbi Granule 1.875 g/ (kg·d), 1.35 g/ (kg·d), 0.625 g/ (kg·d) by gavage. The western medicine group was given cilostazol 45 mg/(kg·d) by gavage, all the rats were treated for 6 weeks. The general situation, body weight and blood glucose of rats were observed, and the expression of HIF-1mRNA and VEGFmRNA were detected by real-time quantitative PCR. Results The weight of the rats of large, medium and small dose group were significantly higher than those in the model group (P<0.05), after 6 weeks’ treatment. Moreover, the rats body weight of medium dose group was significantly higher than that of large and small dose group (P<0.05). Blood sugar level of medium dose group was significantly lower than that of model group and other groups (P<0.05). In model group the expression levels of HIF-1αmRNA and VEGFmRNA were significantly higher than those in the blank group (P<0.05); in the treatment group the expression levels of HIF-1αmRNA and VEGFmRNA were significantly lower than those in the model group (P<0.05) ; the expression levels of HIF-1αmRNA and VEGFmRNA in medium dose group were significantly lower than that of large dose group (P<0.05). Conclusion Xiaoke TongBi Granule can increase HIF-1αmRNA and VEGFmRNA expression in the ischemic muscular tissue and promote angiogenesis, improve diabetic ischemic status of the limb.

diabetes mellitus; Xiaoketongbi Granule; HIF-1αmRNA; VEGFmRNA

张效科，男，教授，博士生导师，主任医师，研究方向为糖尿病及其并发症的中医药防治。

袁有才，E-mail:yyc0807@163.com

国家自然科学基金资助项目(81273750；81374028)；陕西省自然科学基金资助项目(2012jM4016)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.17.001

R-332

A

1008-8849(2016)17-1825-03

2016-02-25