血管内皮生长因子及其受体在伴恶性胸腔积液非小细胞肺癌组织中的表达

王　园，田　野，刘思洋，赵希彤，姜文军，田大力

（中国医科大学附属第四医院胸心外科，沈阳110032）

血管内皮生长因子及其受体在伴恶性胸腔积液非小细胞肺癌组织中的表达

王园，田野，刘思洋，赵希彤，姜文军，田大力

（中国医科大学附属第四医院胸心外科，沈阳110032）

目的测定血管内皮生长因子（VEGF）和血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR）在非小细胞肺癌伴恶性胸腔积液中表达情况，分析VEGF和VEGFR与恶性胸腔积液的关系。方法采用免疫组织化学法检测12例伴有恶性胸腔积液的胸膜转移癌组织和18例不伴有胸腔积液的癌组织中VEGF和VEGFR的表达情况，分析和探讨VEGF和VEGFR与恶性胸腔积液的关系。结果恶性胸腔积液组中VEGF和VEGFR的表达明显高于不伴恶性胸腔积液组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论非小细胞肺癌恶性胸腔积液与VEGF和VEGFR的高表达密切相关。

血管内皮生长因子；血管内皮细胞生长因子受体；非小细胞肺癌；恶性胸腔积液

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恶性胸腔积液是晚期肺癌最主要的并发症之一，尤其是转移性腺癌，据报道［1］约15%的肺癌患者在确诊时已有胸腔积液，50%的肺癌患者在病程中会出现胸腔积液，而恶性胸腔积液（malignant pleural effusion，MPE）往往预示着较差的预后和较短的生存期。

关于MPE的形成原因至今仍在研究中，最新的研究［2］显示血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是在MPE发病机制中起重要作用的细胞因子。VEGF与血管内皮上的血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）结合后，通过一系列信号传导机制导致血管内皮细胞分裂增殖，同时增加血管通透性，有效激活血管生成和提高毛细血管通透性，使血浆蛋白外渗，为胸腔积液的形成提供合适的微环境，诱发MPE形成［3］。另一方面，VEGF在肺癌的生长、浸润、转移过程中起重要作用，VEGF的表达与肺癌的淋巴结和远处转移有密切联系，VEGF表达阳性者，淋巴结和远处转移明显增多［4］。结合前期查阅文献，发现MPE的发生与VEGF通路的表达可能存在着相关性。为了探讨VEGF和VEGFR与MPE生物学行为之间的关系，本研究检测Ⅳ期非小细胞肺癌合并MPE患者的胸膜组织内VEGF和VEGFR的表达情况，旨在找出VEGF和VEGFR与MPE的联系，从而进一步分析MPE的形成机制，为治疗提供理论基础。

1　材料与方法

1.1研究对象

本研究共收集2013年1月至2014年7月于中国医科大学附属第四医院住院的Ⅳ期非小细胞肺癌患者30例。其中伴胸腔积液患者12例（MPE组），不伴胸腔积液患者18例（对照组，即非MPE组）；男14例，女16例，中位年龄63（42～84）岁，有吸烟史11例，无吸烟史19例，全部病例均经病理证实为非小细胞肺癌，签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本的采集：MPE组12例均经胸腔镜取胸膜转移癌组织，病理证实均为腺癌，非MPE组均经皮肺穿刺取癌组织，其中16例为腺癌，2例为非小细胞肺癌，所取标本均按照免疫组化染色要求进行固定，包埋，脱水，切片作免疫组化备用。

1.2.2免疫组织化学SP法：所得标本进行石蜡切片，常规脱蜡至水；0.3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10～30 min，以灭活内源性过氧化物酶活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；采用微波（30 min内4次，中火）、高压、酶修复方法进行抗原修复；自然冷却；血清封闭，室温15～30 min，与二抗来源一致。倾去，勿洗；滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2～3 h。PBS冲洗，3 min×5次；滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30 min～1 h；PBS冲洗，3 min×5次；滴加链霉亲和素-过氧化物酶，室温或37℃孵育30 min～1 h。PBS冲洗，3 min×5次；显色剂显色（DAB等）；充分冲洗；中性树脂封固。

1.2.3结果判断标准：阳性染色超过10%时判断为VEGF和VEGFR阳性［6］。阳性范围在10%～＜50%者为VEGF和VEGFR低表达，50%～100%者为VEGF和VEGFR高表达。

1.2.4统计学分析：采用SPSS 11.5统计学软件包对所得数据进行Fisher确切概率法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1VEGF和VEGFR的表达情况

VEGF主要表达于肿瘤细胞的细胞质中，阳性染色位于细胞质中，呈棕黄色颗粒状，背景清晰；VEGFR则主要表达于肿瘤细胞的细胞膜上，阳性染色位于细胞膜上，呈棕黄色颗粒状，背景清晰（图1A），MPE组高表达（图1B），非MPE组阴性表达（图1C），非MPE组低度表达（图1D）。

图1　免疫组化SP检测VEGF和VEGFR在胸膜转移癌组织及肺癌组织中的表达情况×200Fig.1 Immunohistochemical SP detection of VEGF and VEGFR expression in pleural and lung tumors tissues×200

在MPE组中，VEGF阳性表达率为83.33%，其中高表达率为58.33%；而非MPE组中VEGF的表达率为33.33%，高表达率仅为11.11%（表1）。另一方面，在MPE组中VEGFR阳性表达率为75.00%，高表达率为58.33%，而非MPE组VEGFR表达率27.78%，高表达率为11.11%（表2）。肺癌伴MPE组VEGF和VEGFR的阳性表达率以及高表达率均明显高于肺癌不伴MPE组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2VEGF和VEGFR的表达与临床病理因素之间的关系

表1　VEGF在MPE组及非MPE组的表达情况Tab.1 Expression of VEGF in MPE group and non-MPE group

表2　VEGFR在MPE组及非MPE组的表达情况Tab.2 Expression of VEGFR in MPE group and non-MPE group

比较VEGF和VEGFR的表达与临床病理参数的关系，发现30例Ⅳ期患者中，女性VEGF和VEGFR阳性表达率均高于男性，但差异无统计学意义；VEGF和VEGFR阳性表达率与年龄、有无吸烟史等临床病理参数均无关（P＞0.05），见表3。

表3　VEGF和VEGFR的表达与临床病理因素的关系Tab.3 The relationship between the expressions of VEGF and VEGFR and clinical pathological characteristics

3　讨论

VEGF最早是1989年从培养的牛垂体滤泡星状细胞中分离出的一种多肽，是血小板源生长因子超家族的一员，目前主要包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子。VEGF的生物活性是通过与其受体VEGFR结合后发挥的，目前发现的受体VEGFR有5种：VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDR）、VEGFR-3（Flt-4）、NP-1和 NP-2，其中VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3均是受体酪氨酸蛋白激酶，前两者主要在血管内皮细胞上表达，后者主要存在于淋巴管内皮细胞；而NP-1和NP-2为非酪氨酸蛋白激酶跨膜受体，含有长的胞外段和短的胞内段，不仅在内皮细胞表达，在某些肿瘤细胞内也有表达。VEGF家族是一种高度特异的血管内皮有丝分裂原，通过与VEGFR结合，引起一系列的信号转导，释放多种细胞因子，刺激血管（淋巴管）内皮细胞增殖和迁移［7］，促进新生血管及淋巴管生成，在肿瘤的生长和转移中起重要作用。

MPE亦称肿瘤性胸腔积液，大多数病例可以在胸腔积液中找到恶性细胞。如果胸腔积液伴纵隔或胸膜表面转移性结节，无论在胸腔积液中能否找到恶性细胞，均可以诊断恶性胸腔积液。在引起胸腔积液的恶性肿瘤中，较常见的为肺癌、乳腺癌、淋巴癌，其中以肺癌居多。正常人体壁层胸膜的间皮细胞间有很多2～12 nm的小孔，该孔隙直接与淋巴网相通。正常情况下，成人胸膜腔24 h能产生100～200 mL胸液，由壁层胸膜滤出，再经壁层胸膜的小孔重吸收，而脏层胸膜对胸液的形成和重吸收作用很小。胸腔内液体不断产生，不断被重吸收，保持动态平衡，当这种平衡被打破时，就可引起胸腔积液。MPE产生的机制复杂多样，包括恶性肿瘤侵袭脏层和壁层胸膜或伴随的炎症使毛细血管通透性增加，液体渗入胸膜腔；转移至壁层或脏层的肿瘤细胞阻塞壁层、脏层胸膜血管及淋巴管，使正常的胸液循环被打破；肿瘤转移至纵膈淋巴结引起胸腔积液的吸收减少等［8］。

VEGF和VEGFR具有增加血管通透性，有效激活血管生成和提高毛细血管通透性的作用，推测VEGF和VEGFR是参与MPE形成的分子机制，在MPE的形成中起着重要作用。基于以上原因，本研究检测胸膜转移癌组织中VEGF和VEGFR的表达情况，与未发生胸膜转移的癌组织进行对比，有效地模仿了肿瘤的恶性行为。本研究中胸膜转移癌组织的VEGF和VEGFR阳性表达率及阳性程度明显高于未发生胸膜转移的癌组织，提示VEGF和VEGFR与肺癌MPE密切相关，在肺癌MPE的形成中起重要作用，这与文献［9-10］报道相符。

近年来以VEGF和VEGFR为靶点的抗肿瘤新生血管药物备受关注，为晚期肿瘤患者和体力状态评分低不能耐受化疗的患者提供了新的治疗途径。研究［11］表明在体外血管生成模型上，VEGF与其相应的受体结合，导致内皮细胞增殖和新生血管形成，达到阻断VEGF生物功能的作用。同样，VEGFR作为VEGF信号转导的受体，主要作用是介导VEGF的血管内皮细胞增生，趋化内皮细胞和增加血管通透性等。针对以VEGFR为靶点的血管生成抑制剂已有报道，部分药物（如厄洛替尼）已应用于临床。结合本研究结果，VEGF和VEGFR在恶性胸腔积液中高表达，两者与MPE的形成密切相关。这提示抗肿瘤新生血管药物可通过阻断VEGF和VEGFR的生物功能达到控制MPE生成的效果。目前关于MPE的治疗主要包括穿刺放液和腔内置管闭式引流、药物治疗和外科治疗。其中药物治疗是MPE最主要的方法，但效果有限。而关于抗肿瘤新生血管药物治疗MPE的报道也较少，随着对VEGF和VEGFR与肺癌伴MPE关系的深入研究，以VEGF和VEGFR为靶点的抗肿瘤新生血管药物将会为晚期肺癌伴胸腔积液患者提供新的治疗途径、带来新曙光。

［1］Bradshaw M，Mansfield A，Peikert T.The role of vascular endothelial growth factor in the pathogenesis，diagnosis and treatment of malignant pleural effusion［J］.Curr Oncol Rep，2013，15（3）：207-216.

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［3］万博，文煜.作用于VEGF信号通路的血管生成抑制剂［J］.药学进展，2010，34（6）：256-263.

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［5］张娜，王文彤，陶遵威.非小细胞肺癌分子靶向治疗的最新进展［J］.天津药学，2015，27（1）：48-50.

［6］王国凤，陈培辉，曹敏，等.肺癌及其癌旁组织中EGFR的表达及意义［J］.肿瘤研究与临床，1997，9（1）：1-3.

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（编辑于溪）

VEGF and VEGFR Expressions in Non-small Cell Lung Cancer with Malignant pleural Effusion

WANG Yuan，TIAN Ye，LIU Siyang，ZHAO Xitong，JIANG Wenjun，TIAN Dali
（Department of Thoracic Surgery，the Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China）

Objective To investigate the expression of VEGF and VEGFR in non-small cell lung cancer patients with malignant pleural effusion，and analyze the relationship between VEGF and VEGFR and malignant pleural effusion.Methods The VEGF and VEGFR expression were detected using immunohistochemistry in pleural and lung tumors tissues of 30 Ⅳ stage non-small cell lung cancer patients，and the relationship between VEGF and VEGFR expression and malignant pleural effusion was analyzed.Results The expression of VEGF and VEGFR in pleural tissue of patients with malignant pleural effusion was significantly higher than those without malignant pleural effusion（P＜0.05）.Conclusion There is a very close correlation between high expression of VEGF and VEGFR and formation of malignant pleural effusion.

vascular endothelial growth factor；vascular endothelial growth factor receptor；non-small cell lung cancer；malignant pleural effusion

R743.2

A

0258-4646（2016）05-0441-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.05.015

沈阳市科学技术计划（F13-316-1-07）

王园（1989-），男，硕士研究生.

姜文军，E-mail：Cmu4hjwj@126.com

2015-07-02

网络出版时间：