CTGF siRNA对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的影响

丁　爽，方　芳，段宏梅，肖卫国

（中国医科大学附属第一医院风湿免疫科，沈阳110001）

CTGF siRNA对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的影响

丁爽，方芳，段宏梅，肖卫国

（中国医科大学附属第一医院风湿免疫科，沈阳110001）

目的小干扰RNA技术沉默结缔组织生长因子（CTGF）表达，并观察对类风湿关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLS）凋亡及对部分凋亡相关基因的影响。方法脂质体转染CTGF siRNA至FLS，real time PCR筛选出有效的CTGF siRNA。使FLS CTGF表达沉默后，采用FITC-PI双染法通过流式细胞仪检测对FLS凋亡的影响。Real-time PCR检测CTGF基因沉默对bax、bclxl和survivin等凋亡相关基因表达的影响。结果筛选出H-1序列是针对人CTGF的特异性SiRNA，抑制率＞70%。在外源性CTGF作用下，由去血清导致的FLS凋亡明显减少；沉默FLS中的CTGF基因表达，FLS的凋亡明显增加。在FLS中CTGF基因表达沉默后，Bax基因表达上调，bcl-xl基因表达下调，但差异没有统计学意义（P＞0.05）。survivin基因表达出现明显下调（P＜0.01）。结论CTGF减少RA FLS凋亡的保护性作用很可能是通过维持survivin表达来实现的。

结缔组织生长因子；成纤维样滑膜细胞；凋亡

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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种主要累及外周关节的常见自身免疫性疾病，滑膜的慢性炎症是其主要病变之一。有研究表明成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）的增殖与凋亡失衡在RA的滑膜病变中发挥主要作用［1］。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）是一种富含半胱氨酸的生长调节因子，病理状态下的过度表达与多种增生性或纤维化性疾病相关，最近有研究［2］显示它可能参与RA的发生和发展。RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）是一种转录后沉默基因的强大工具，小干扰RNA（small interfered RNA，siRNA）可以用来研究在各种组织中基因产物的功能［3］。CTGF在RA疾病中的研究已经取得了初步进展［4］，拮抗CTGF活性的研究成为防治RA所致滑膜细胞增殖的新策略。

本实验筛选出在FLS干扰效果达70%以上的siCTGF，通过流式细胞仪检测CTGF siRNA干扰对体外培养的FLS凋亡的影响，real-time PCR方法检测bax、bcl-xl、survivin等凋亡相关基因表达，分析应用小干扰RNA对类风湿关节炎滑膜病变的干预作用，进一步探讨CTGF在RA发病中可能作用机制。

1　材料与方法

1.1标本及试剂

滑膜组织取材于中国医科大学附属第一医院骨科行关节镜滑膜切除术或关节置换术的3例RA患者，所有标本取得均获得患者知情同意。患者诊断均符合2010年美国风湿病学会（ACR）修订的类风湿关节炎的分类诊断标准。试剂主要包括：重组人CTGF（rhCTGF，Biovender Laboratory Medicine公司）、Lipofecamine2000（美国Invitrogen Life Technologies公司）、Annexin V-FITC试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）、荧光定量PCR试剂盒（大连宝生物公司）、Trizol Reagent（美国Invitrogen Life Technologies公司）

1.2方法

1.2.1RA FLS的培养和鉴别：磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗滑膜组织，反复剪切成约1 mm×1 mm×1 mm的细小组织块，加入胶原酶Ⅰ（1 mg/mL）37℃消化2 h，70 μm尼龙网过滤收集细胞，加入DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，待细胞长成梭形并80%融合成片后传代。免疫组化法鉴定，99%的第3代细胞抗Vimentin抗体阳性同时抗CD68抗体阴性，鉴定为FLS。实验用第3～7代细胞。

1.2.2CTGF siRNA干扰试验：根据Gen Bank数据，由上海吉玛制药技术有限公司人工合成3对随机siRNA。转染前1 d将FLS以2×105/孔铺于24孔板，使转染时密度能够达到80%。分别加入转染试剂Lipofectamine2000与对照SiRNA（SiNC）和CTGF特异性SiRNA（SiCTGF）的复合物，37℃、5%的CO2培养箱中培养4 h后更换为正常含血清的培养基，转染6 h通过荧光显微镜检测转染效果。转染至24 h后，加Trizol，收集细胞，real-time PCR检测转染效率及凋亡相关基因（bax、bcl-xl、survivin）的表达。

1.2.3Annexin V-FITC和PI双染检测FLS凋亡：转染前1 d将细胞铺板于6孔板中使转染时密度能够达到80%。分别加入无血清培养基，25 ng/mL的rhCTGF、siNC和siCTGF，转染步骤同1.2.2。24 h后收集细胞，加入Annexin V-FITC和碘化丙锭溶液上流式细胞仪进行检测分析。

1.2.4Real-time PCR检测CTGF和部分凋亡相关基因的表达：根据人CTGF基因的基因序列（Gen bank登录号：NM_001901），按Primer Premier 6.0软件设计引物，见表1。收集FLS细胞，加Trizol提取总RNA，逆转录合成cDNA，将荧光染料SYBR和目的基因与内参18 S的引物混匀后，加入real-time PCR检测板密封上机检测（ABI7500）。反应条件：95℃30 s 1个循环，95℃5 s 60℃34 s 40个循环，95℃15 s 60℃1 min 95℃15 s 1个循环。根据PCR反应信号强度Ct值计算每个样本的基因相对表达量。

表1　Real-time PCR检测基因及引物序列Tab.1 Gene and primer sequence for real-time PCR

1.3统计学分析

采用Graphpad prism 5.0进行作图和分析。实验数据用表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1CTGF siRNA筛选

我们分别设计了3条针对人CTGF基因的双链小RNA（siRNA），同时用与哺乳动物无关的siRNA作为阴性对照（siRNA of negative control，siNC）。用脂质体（Lipofectamine2000）将siRNA转染到细胞中，荧光显微镜观察表明转染成功，见图1。Realtime PCR检测干扰24 h后CTGF的表达水平，H-1、H-2、H-3抑制率分别为77%、44%和2%，其中H-1是针对人CTGF的特异性siRNA，抑制率＞70%，因此，选用这一siRNA进行FLS凋亡实验。

2.2CTGF对FLS凋亡的影响

向培养的饥饿的FLS中加入外源性的CTGF，用V-FITC和PI双染的方法通过流式细胞仪检测FLS的凋亡。在外源性的CTGF作用下，由去血清导致的FLS凋亡明显减少。沉默FLS中的CTGF基因表达，FLS的凋亡明显增加，见图2。

2.3CTGF siRNA对凋亡调控因子表达的影响

图1　荧光显微镜下观察CTGF siRNA转染×100Fig.1 Transfection of CTGF siRNA under fluorescence microscope×100

CTGF基因沉默后，real-time PCR检测结果显示：bax、bcl-xl和survivin基因相对表达量分别为1.28±0.08，0.59±0.07和0.36±0.07。bax基因表达上调，bcl-xl基因表达下调，但差异没有统计学意义（P＞0.05）。survivin基因表达出现明显下调（P＜0.01）。这些结果表明，CTGF很可能是通过增加survivin基因的表达产生对FLS的正向调节作用。

3　讨论

图2　外源性CTGF、siCTGF对FLS凋亡的影响Fig.2 Effects of rhCTGF/siCTGF on FLS apoptosis

RNA干扰（RNAi）是由长21～23个碱基对的双链RNA介导，通过碱基互补配对，导致序列特异的基因沉默。目前，已被广泛应用于探索基因功能、防治病毒感染以及治疗肿瘤等。siRNA安全高效，是近年应用最为广泛的特异性基因功能研究方法。本研究发现在外源性的CTGF作用下由去血清作用导致的FLS凋亡明显减少。随后针对CTGF mRNA 3个不同位点设计了3组siRNA，通过干扰后CTGF表达变化筛选出干扰效率最高的CTGF特异性siRNA，用这一siRNA转染FLS，沉默FLS中CTGF基因表达，FLS凋亡增加，提示CTGF可能参与了FLS凋亡减少。

在RA发病机制中，FLS增殖的增加和（或）凋亡的减少均导致滑膜增生。survivin作为凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族成员之一，是迄今发现最强的凋亡抑制因子，也是目前分子量最小的IAP蛋白。近年来多项研究［5～7］表明survivin参与RA的发病。Svensson等［5］研究发现早期RA患者血清中survivin的表达对患者关节侵蚀度和治疗的效果有一定的预测性。Bokarewalz等［6］研究发现有关节破坏的RA患者关节滑液中survivin水平显著高于没有关节破坏的患者，同时改变病情抗风湿药可降低RA患者关节滑液中survivin水平。Ahn等［7］研究发现survivin蛋白在RA滑膜细胞中高表达与关节破坏程度呈明显的正相关。本研究结果证明通过siRNA使CTGF表达沉默后，会使由去血清导致的FLS凋亡明显增加，同时survivin mRNA表达明显减低。因此认为CTGF阻止RA FLS的凋亡，这种保护性作用很可能是通过维持survivin的表达来实现的。

有关CTGF与细胞凋亡的关系在不同研究中还存在争议。在有些研究中，CTGF发挥促进细胞凋亡的作用，比如近来有国内学者［8］研究发现外源性重组CTGF能够促进肾小管细胞的凋亡，同时CTGF siRNA减少肾小管细胞的凋亡；而在另一些研究中CTGF又发挥抑制细胞凋亡的作用，有学者［9］发现骨肉瘤患者过表达CTGF会对顺铂介导的细胞凋亡抵抗增加。本研究发现抑制CTGF活性可显著增加FLS细胞凋亡，提示CTGF在RA滑膜病变过程中可能发挥抑制FLS凋亡的作用，而FLS细胞凋亡功能降低导致细胞过度增生和活化也是RA滑膜病变形成和发展的重要原因之一。

然而，CTGF是一种具有多效性的基质蛋白，在不同类型的细胞中及不同的环境因素下CTGF的生物学功效可能截然不同，CTGF的多效性也决定了它可能在炎症过程的不同阶段通过多种途径影响炎症的多种环节来起作用。因此，关于CTGF参与RA发病过程的具体机制仍需要进一步的研究来证实及揭示。

［1］Bartok B，Firestein GS.Fibroblast-like synoviocytes：key effector cells in rheumatoid arthritis［J］.Immunol Rev，2010，233（1）：233-255.

［2］Nozawa K，Fujishiro M，Takasaki Y，et al.Inhibition of rheumatoid arthritis by blocking connective tissue growth factor［J］.World J Orthop，2014，11（5）：653-659.

［3］Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］. Nature，1998，39（2）：806-811.

［4］Nozawa K，Fujishiro M，Kawasaki M，et al.Inhibition of connective tissue growth factor ameliorates disease in a murine model of rheumatoidarthritis［J］.Arthritis Rheum，2013，65（6）：1477-1486.

［5］Svensson B，Hafstrom L，Forslind K，et al.Increased expression of proto-oncogene survivin predicts joint destruction and persistent disease activity in early rheumatoid arthritis［J］.Ann Med，2010，42（1）：45-54.

［6］Bokarewa M，Lindblad S，Bokarew D，et al.Balance between surviving，a key member of the apoptosis inhibitor family and its specific antibodies determines erosivity in rheumatoid arthritis［J］.Aithritis Res Ther，2005，7（2）：R3492-3581.

［7］Ahn JK，Oh JM，Lee J，et al.Increased extracellular survivin in the synovial fluid of rheumatoid arthritis patients：fibroblast-like synoviocytes as a potential source of extracellular survivin［J］.Inflammation，2010，33（6）：381-388.

［8］Ren Y，Du C，Yan L，et al.CTGF siRNA ameliorates tubular cell apoptosis and tubulointerstitial fibrosis in obstructed mouse kidneys in a Sirt1-independent manner［J］.Drug Des Devel Ther，2015，9（7）：4155-4171.

［9］Tsai HC，Huang CY，Su HL，et al.CCN2 enhances resistance to cisplatin-mediating cell apoptosis in human osteosarcoma［J］.PLoS One，2014，9（3）：e90159.

（编辑武玉欣）

Effect of CTGF siRNA on Apoptosis of Fibroblast-like Synoviocytes of Rheumatoid Arthritis

DING Shuang，FANG Fang，DUAN Hongmei，XIAO Weiguo
（Department of Rheumatology and Immunology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To silence the expression of CTGF by small interfering RNA technology，to observe the influence on fibroblast-like synovial cell apoptosis and several apoptosis-related genes，and to explore the mechanism of action of CTGF in rheumatoid arthritis synovial lesions.Methods Effective CTGF siRNA was screened through real-time PCR.The influence of CTGF siRNA on FLS apoptosis was detected with FITC-PI double staining by flow cytometry.bax，bcl-xl and survivin were detected using real-time PCR when CTGF mRNA has been silenced.Results Compared with other 2 groups of oligo and NC oligo，H1 oligo exhibited the strongest interfering action to CTGF（inhibition ratio＞70%），so that it is selected as the effective target gene sequence for the following experiment.Apoptosis of FLS induced by serum deprivation was significantly decreased in the presence of exogenous CTGF.When expression of the CTGF gene was knocked down in FLS，FLS apoptosis was significantly increased，and expression levels of survivin mRNA were decreased significantly（P＜0.01）.Conclusion FLS survival is positively regulated by CTGF，which may through the sustaining the expression of survivin.

connective tissue growth factor；fibroblast-like synoviocytes；apoptosis

R593.22

A

0258-4646（2016）05-0430-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.05.012

辽宁省医学高峰建设工程专项经费（2010006）

丁爽（1981-），女，讲师，博士.

肖卫国，E-mail：Xonet5670@163.com

2015-09-15

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