系统性硬化症和混合性结缔组织病活动期血清中LOXL-2的比较

程　瑶，王晓非，张晓莉，张　娜，张新刚

（中国医科大学附属盛京医院风湿免疫科，沈阳110004）

系统性硬化症和混合性结缔组织病活动期血清中LOXL-2的比较

程瑶，王晓非，张晓莉，张娜，张新刚

（中国医科大学附属盛京医院风湿免疫科，沈阳110004）

目的比较赖氨酰氧化酶样蛋白2（LOXL-2）在系统性硬化症（SSc）和混合性结缔组织病（MCTD）活动期患者血清中的表达情况。方法用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测20例SSc和20例MCTD患者中LOXL-2的浓度，进行统计分析。结果在活动期MCTD和SSc患者血清中LOXL-2的蛋白表达量高于对照组（均P＜0.05），且在SSc患者中LOXL-2浓度与患者皮肤病变评分（mRSS）呈正相关（r=0.982 P=0.001）。结论LOXL-2在SSc和MCTD活动期患者的血清中高表达，可能与LOXL-2促进组织纤维化及血管炎的发生相关。

系统性硬化症；混合性结缔组织病；赖氨酰氧化酶样蛋白2；纤维化

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系统性硬化症（systematic sclerosis，SSc）是一种病因不明的以皮肤或内脏器官纤维化、闭塞性血管病变及免疫系统紊乱为主要特征的自身免疫性疾病［1-2］，其他结缔组织病也会出现血管损害等临床表现，以混合性结缔组织病（mixed connective tissue disease，MCTD）最为明显，其以血清中出现抗U1-RNP抗体及同时具备系统性红斑狼疮、皮肌炎、系统性硬化症等相似的临床表现为主要特点［3-5］，MCTD从基因遗传角度似乎区别于其他的结缔组织病［6］，但关于MCTD应该分类为一种独立的疾病、重叠综合征或者是一个未分化的结缔组织病正在进行着激烈的讨论［7］。

赖氨酰氧化酶家族是一种广泛分布于多种组织器官的铜依赖性氨基酸氧化酶，可催化胶原和弹性蛋白中赖氨酸残基形成分子内和分子间的共价交联，这种交叉连接将胶原和弹性蛋白中的可溶性单体转变为细胞外基质中稳定性较强的不溶性纤维［8］，但赖氨酰氧化酶样蛋白2（lysyl oxidase like protein-2，LOXL-2）和SSC、MCTD的关系还不清楚。本研究通过比较SSc和MCTD活动期患者血清中LOXL-2的表达情况，初步探讨LOXL-2在血管、皮肤及脏器纤维化中的作用。

1　材料与方法

1.1临床资料

随机选取20例SSc患者（SSc组，所有患者均符合2013年EULAR/ACR诊断标准［9］），20例MCTD患者（MCTD组至少符合3个诊断标准中的一个，包括修订的1987年Sharp's诊断标准、Alarcón-Segovia或Kasukawa诊断标准［10］，并且排除其他结缔组织病），20例正常对照组患者。研究已获得本单位伦理委员会批准，取得受试者的知情同意。记录患者有无肺间质纤维化（根据患者胸部HRCT结果判断肺间质纤维化严重程度）、有无指趾端溃疡、有无雷诺现象等指标。同时记录SSc患者的皮肤病变评分（modified rodnan skin score，mRSS）。

1.2标本采集

血液标本在室温下离心30 min并且储存于-70°C冰箱。用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中LOXL-2含量，试剂盒购自R&D生物公司。实验步骤按照说明书进行，酶标仪450 nm处测OD值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算出LOXL-2浓度。

1.3统计学分析

数据采用SPSS软件进行统计分析，以x±s表示。多组间计量资料比较采用单因素方差分析；2组间计量资料比较采用独立样本t检验；LOXL-2水平与临床相关指标之间的关系采用直线相关分析并计算Pearson相关系数（r），P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1LOXL-2在SSc组的表达

LOXL-2在SSc组浓度为（0.32±0.11）ng/mL，在正常对照组为（0.16±0.03）ng/mL，SSc组浓度高于正常对照组（P＜0.001），见图1。

2.2LOXL-2在MCTD组的表达

LOXL-2在MCTD组浓度为（0.47±0.17）ng/mL，MCTD组浓度高于SSc组（P=0.014），正常对照组LOXL-2浓度为（0.16±0.03）ng/mL，MCTD组浓度高于正常对照组（P＜0.001），见图1。

图1　SSc组和MCTD组患者与对照组血清LOXL-2的表达Fig.1 Comparison of serum LOXL-2 levels among the patients groups and control group

2.3LOXL-2血清浓度与SSc和MCTD临床参数的相关分析

SSc和MCTD患者临床参数中最有意义和价值的判断指标是肺间质纤维化，SSc患者组间比较发现有肺间质纤维化组与无肺间质纤维化组的血清LOXL-2浓度平均值分别为0.39 ng/mL和0.22 ng/mL，而MCTD患者组间比较发现有肺间质纤维化组与无肺间质纤维化组的血清LOXL-2浓度平均值分别为0.53 ng/mL和0.34 ng/mL，组间差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

分析SSc患者的mRSS评分，发现mRSS评分越高，血清中LOXL-2浓度越大（r=0.982，P=0.001），见图2。SSc和MCTD患者其他临床参数如血沉、C-反应蛋白、ANA滴度、免疫球蛋白A、G、M、补体C3、C4等指标与LOXL-2浓度之间均无相关性（P均＞0.05）。

表1　血清LOXL-2表达与SSc和MCTD临床特征的关系Tab.1 Correlations between serum LOXL-2 levels and clinical manifestations of systemic scleroderma and mixed connective tissue disease

图2　LOXL-2表达与mRSS评分的关系Fig.2 Correlation between the expression of LOXL-2 and mRSS scores

3　讨论

LOXL-2是存在于哺乳动物中的铜依赖性氨基酸氧化酶，LOXL-2作为促进胶原蛋白和纤维蛋白共价交联的关键酶，能够催化细胞外基质蛋白，如胶原和弹性蛋白中赖氨酸残基ε-氨基的氧化脱氨，产生的醛基通过Schiff′s碱的形成或者丁醛醇的缩合反应形成分子内和分子间共价交叉连接，这种交叉连接将胶原和弹性蛋白的可溶性单体转变为细胞外基质中稳定性较强的不溶性纤维，LOXL-2还具有影响细胞增殖和细胞趋化以及抑制或促进肿瘤形成等功能［11］。

MCTD和SSc都属于自身免疫性疾病，且病理共同涉及脏器受累、血管病变及皮肤纤维化，但这2种病具有不同的脏器受累和皮肤纤维化程度，且MCTD血清学化验中出现高效价斑点型抗核抗体及抗U1-RNP抗体，并具有多种结缔组织病（系统性红斑狼疮、硬皮病、多发性肌炎等）的混合临床表现。

本研究结果显示LOXL-2在SSc及MCTD中浓度显著高于正常对照组，提示在皮肤及内脏纤维化的过程中LOXL-2可能通过作用于胶原蛋白和纤维蛋白的共价交联发挥重要作用。进一步研究发现LOXL-2浓度在MCTD组高于SSc组、肺间质纤维化组LOXL-2水平明显高于无肺间质纤维化组，在SSc患者中LOXL-2水平与硬皮病患者皮肤病变严重程度成正相关，由此可推测LOXL-2可作为评价疾病严重程度及患者预后的关键因素，推测可能与LOXL-2酶的参与有关。LOXL-2作为促进胶原蛋白和纤维蛋白共价交联的关键酶，尚未查阅到LOXL-2在SSc及MCTD中相关文献报道。因SSc和MCTD发病率低、患病人数少，研究呈现一定局限性，统计学意义有限，有待扩大样本量。LOXL-2在SSc及MCTD发病及病程中的具体作用和机制还需进一步研究。

［1］Mayes MD，Lacey JV，Beebe-Dimmer J，et al.Prevalence，incidence，survival，and disease characteristics of system sclerosis in a large US population［J］.Arthritis Rheum，2003，48（8）：2246-2255.

［2］Sakkas LI.New developments in the pathogenesis of systemic sclerosis［J］.Autoimmunity，2005，38（2）：113-116.

［3］Viswanath V，Phiske MM，Gopalani VV.Systemic sclerosis：current concepts in pathogenesis and therapeutic aspects of dermatological manifestations［J］.Indian J Dermatol，2013，58（4）：255-268.

［4］Kuwana M，Okazaki Y，Yasuoka H，et al.Defective vasculogenesis in systemic sclerosis［J］.Lancet，2004，364（9434）：603-610.

［5］Steen VD，Medsger TA.Changes in causes of death in systemic sclerosis，1972-2002［J］.Ann Rheum Dis，2007，66（7）：940-944.

［6］Flam ST，Gunnarsson R，Garen T，et al.The HLA profiles of mixed connective tissue disease differ distinctly from the profiles of clinically related connective tissue diseases［J］.Rheumatology（Oxford），2015，54（3）：528-535.

［7］Swanton J，Isenberg D.Mixed connective tissue disease：still crazy after all these years［J］.Rheum Dis Clin N Am，2005，31（3）：421-436.

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［9］Braun-Moscovici Y，Braun M，Khanna D，et al.What tests should you use to assess small intestinal bacterial overgrowth in systemic sclerosis？［J］.Clin Exp Rheumatol，2015，33（4 Suppl 91）：S117-122.

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［11］Saad FA，Torres M，Wang H，et al.Intracellular lysyl oxidase：effect of a specific inhibitor on nuclear mass in proliferating cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，396（4）：944-949.

（编辑于溪）

Comparison ofLOXL-2 Expression between Active Systematic Scleroderma and Active Mixed Connective Tissue Disease

CHENG Yao，WANG Xiaofei，ZHANG xiaoli，ZHANG Na，ZHANG Xingang
（Department of Rheumatology and Immunology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the expression of lysyloxidase like protein-2（LOXL-2）in the sera of patients with active systemic scleroderma（SSc）and mixed connective tissue disease（MCTD）.Methods An enzyme-linked immunosorbent assay was adopted to measure LOXL-2 in the serum of20 patients with active SSc，20 patients with active MCTD，and 20 healthy controls.The measurements among different groups was compared，and correlations between LOXL-2 levels and clinical manifestations of SSc and MCTD were examined.Results The levels of LOXL-2 expression in MCTD and SSc groups were significantly higher than those in control group（P＜0.05 for all groups）.LOXL-2 expression is also related to the presence of skin lesions in SSc（r=0.982 P=0.001）.Conclusion High serum level of LOXL-2 in these patients with active SSc and active MCTD suggests that LOXL-2 may be involved in the process of fibrosis and the resulting vasculitis in multiple organs.

systematic scleroderma；mixed connective tissue disease；lysyl oxidase like protein-2；fibroblast

R593.25

A

0258-4646（2016）05-0414-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.05.008

辽宁省科学技术计划（2014225017）；辽宁省博士科研启动基金（20141043）；沈阳市科学技术计划（F12-193-9-41）

程瑶（1989-），女，硕士研究生.

王晓非，E-mail：wangxf@sj-hospital.org

2015-11-12

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