MMP-9在氧诱导小鼠视网膜新生血管形成中的表达

底　煜，杨　飏，陈晓隆

（中国医科大学附属盛京医院眼科，沈阳110004）

MMP-9在氧诱导小鼠视网膜新生血管形成中的表达

底煜，杨飏，陈晓隆

（中国医科大学附属盛京医院眼科，沈阳110004）

目的研究基质金属蛋白酶9（MMP-9）在氧诱导小鼠视网膜新生血管（RNV）形成中的表达，探讨MMP-9抑制剂（GM6001）对RNV形成的抑制作用。方法高氧诱导建立小鼠RNV模型。在出氧箱前1 d（即鼠龄11 d），分别给予GM6001治疗组和高氧对照组小鼠玻璃体腔内注射GM6001（100 μmol/L）1 μL和等量PBS液，正常对照组和高氧组不做处理。采用HE染色方法观察RNV情况，采用免疫组织化学、Western blot和RT-PCR法检测MMP-9蛋白及基因的表达情况。结果高氧组和高氧对照组可见大量RNV形成，而GM6001治疗组RNV形成明显减少。与正常对照组相比，高氧组和高氧对照组MMP-9蛋白及基因表达水平显著升高，GM6001治疗组较高氧对照组显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论MMP-9的异常表达可能与RNV形成密切相关，GM6001能有效抑制RNV的形成。

视网膜新生血管；基质金属蛋白酶9；早产儿视网膜病变

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早产儿视网膜病变（retinopathy of prematurity，ROP）是儿童主要的致盲眼病，其病理生理改变的基础是视网膜新生血管（retinal neovascularization，RNV）形成［1］。研究表明，在ROP的发生发展过程中，细胞因子发挥了重要作用。细胞因子基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9），即Ⅳ型胶原酶，能降解变性的胶原和Ⅳ型胶原蛋白，促进内皮细胞的迁移、趋化，并促进新生血管的形成［2］，参与肿瘤的浸润、转移，在肿瘤的发生中发挥重要作用［3-5］。但有关MMP-9在眼部新生血管性疾病中的作用的研究目前较少见，因此，本研究拟通过高氧诱导构建小鼠ROP模型，观察MMP-9蛋白及基因在其RNV中的表达情况，探讨MMP-9的抑制剂（GM6001）对RNV形成的作用。

1　材料与方法

1.1实验动物与试剂

1.1.1实验动物及分组：健康清洁级C57BL/6J新生小鼠120只，7日龄，雌雄不限，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。将小鼠随机分为正常对照组、高氧组、高氧对照组和GM6001治疗组，每组30只。高氧对照组及GM6001治疗组小鼠分别于出氧箱前1 d（即鼠龄11 d）接受玻璃体腔内注射1 μL PBS或等量GM6001（100 μmol/L）。注射后立即放回氧箱，1 d后小鼠重新出氧箱。所有小鼠与哺乳母鼠一起饲养，且均遵循视觉与眼科学研究会制定的科研动物使用规范。

1.1.2主要试剂：兔抗鼠MMP-9多克隆抗体（中国Boster公司）；SABC试剂盒（中国Boster公司）；PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）；PCR引物（中国Invitrogen公司）；GM6001（Chemicon公司，美国）。

1.2方法

1.2.1小鼠ROP模型的建立：将高氧组、高氧对照组和GM6001治疗组小鼠与母鼠一起置于密封的玻璃容器内，测氧仪监测调控氧浓度，氧浓度控制在75%±2%。室内使用日光灯照明，明暗周期12 h（06：00～18：00）。高氧环境下饲养5 d后，回到正常空气环境中饲养。正常对照组与母鼠一直于正常空气环境下饲养。选取每组小鼠的左眼作为实验眼，右眼作为自身对照眼。各组均于出生后17 d处死并进行后续实验。

1.2.2视网膜新生血管内皮细胞核计数：每组取17日龄小鼠15只处死并摘除眼球。4%多聚甲醛溶液固定24 h，常规脱水，石蜡包埋，HE染色。每只眼球间断取10个切片，每张切片随机选取10个不连续视野，计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数（反映RNV增生的程度［6］）。

1.2.3免疫组织化学法测定MMP-9蛋白的表达：按链霉素抗生物素蛋白-生物素复合物（SABC）法说明进行MMP-9免疫组织化学检测。PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色。MMP-9表达的阳性细胞为细胞质或细胞核内有淡黄色至棕褐色着染颗粒。应用MetaMorph/Evolution MP5.0/BX51软件对视网膜中MMP-9阳性细胞进行分析（×400），测定阳性细胞的积分光密度值（IOD），取平均值作为分析指标。

1.2.4Western blot检测MMP-9蛋白的表达水平：每组取17日龄小鼠15只处死后，收取小鼠视网膜组织，提取视网膜总蛋白。电泳分离转印至纤维素膜上，加碱性磷酸酶标记的二抗杂交，进行化学发光、显影和定影，GAPDH作为内参照。结果通过Chemi Imager 5500 V2.03图像分析系统扫描，Fluor Chen 2.0软件进行整合光密度（IDV）分析。目的蛋白的相对表达量为目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值［7］。抑制效率=（高氧对照组蛋白相对表达量－GM6001治疗组蛋白相对表达量）/高氧对照组蛋白相对表达量×100%。

1.2.5RT-PCR检测MMP-9 mRNA的表达水平：每组各取17日龄小鼠15只处死后，收取小鼠视网膜组织，按照试剂盒说明书提取R NA。每20 μL反转录体系中加入1 μg总RNA进行反应，测cDNA浓度，PCR扩增以cDNA为模板，GAPDH为内参基因，引物序列如下。MMP-9，F 5′-GGAGACCTGAGAAC CAATCTC-3′，R 5′-TCCAATAGGTGATGTCGT-3′，扩增产物长度277 bp；GAPDH，F 5′-CCCATCTATG AGGGTTACGC-3′，R 5′-TTTAATGTCACGCACGA TTTC-3′，扩增产物长度150 bp。反应条件：预热95℃30 s，95℃变性5 s，60℃退火31 s，72℃延伸2 min，共50个循环，72℃延伸10 min。MMP-9 mRNA的相对表达量为实验组目的基因表达相对于对照组的变化倍数，即2-△△Ct值［8］，而△△Ct=（Ct实验组目的基因-Ct实验组内参基因）-（Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因）。抑制效率=（高氧对照组mRNA相对表达量-GM6001治疗组mRNA相对表达量）/高氧对照组mRNA相对表达量×100%。

1.3统计学分析

2　结果

2.1突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核计数

光镜下各组17日龄小鼠视网膜结构层次清晰。正常对照组未见明显突破视网膜内界膜新生血管内皮细胞核；高氧组和高氧对照组可见数目不一的血管穿过内界膜，进入玻璃体腔，新生血管内皮细胞核计数明显高于正常对照组，差异有统计学意义（22.32±2.35，20.13±1.43 vs 3.05±0.78，t1=13.25，t2=11.19，P＜0.05）。GM6001治疗组较高氧组和高氧对照组内皮细胞核数明显减少（6.52±1.07 vs 22.32±2.35，20.13±1.43，t1=10.41，t2=11.15，P＜0.05），见图1。

图1　4组17日龄小鼠RNV内皮细胞核计数情况Fig.1 Numbers of retinal neovascularization endothelial cell nuclei in four groups

2.2免疫组化检测结果

正常对照组视网膜MMP-9蛋白呈弱阳性表达（19.31±2.45），主要定位于神经节细胞层和内丛状层（图2A）；高氧组和高氧对照组MMP-9蛋白呈强阳性表达（分别为36.13±3.13和35.65±2.65），主要定位于神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层和突破视网膜内界膜的新生血管（图2B、2C）；GM6001治疗组MMP-9蛋白表达（22.17±3.01）较高氧组和高氧对照组明显减弱，主要定位于神经节细胞层和内丛状层（图2D）。

图2　免疫组化检测17日龄小鼠视网膜中MMP-9蛋白的表达×400Fig.2 Protein expression of MMP-9 determined by immunohistochemistry in the retina of 17 d mice×400

2.3Western blot检测结果

Western blot检测4组小鼠视网膜中MMP-9蛋白的表达水平，结果（图3）显示各组间差异有统计学意义（F=1 525.210，P＜0.05）。正常对照组小鼠视网膜中可以检测到MMP-9蛋白条带，表明正常小鼠视网膜中能够表达MMP-9蛋白（0.24±0.01）；高氧组（2.13±0.02）和高氧对照组（2.04±0.02）表达显著上调，与正常对照组相比差异有统计学意义（t1= 3.26，t2=4.14，P＜0.05）。高氧组和高氧对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。GM6001治疗组（0.39±0.02）较高氧对照组表达下调，差异有统计学意义（t=2.41，P＜0.05），抑制效率为80.88%。

2.4RT-PCR检测结果

RT-PCR检测4组小鼠视网膜MMP-9mRNA表达水平，结果（图4）显示各组间差异有统计学意义（F=216.503，P＜0.05）。正常对照组视网膜中MMP-9 mRNA表达水平较低（2.04±0.20），高氧组（7.25± 0.16）和高氧对照组（6.25±0.18）较正常对照组表达水平显著上调，差异有统计学意义（t1=2.85，t2=3.57，P＜0.05）。高氧组和高氧对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。GM6001治疗组（2.56±0.16）较高氧对照组表达下调，差异有统计学意义（t=2.17，P＜0.05），抑制效率为59.04%。

图3　Western blot检测17日龄小鼠视网膜中MMP-9蛋白的表达Fig.3 Protein expression of MMP-9 was determined by Western blot in the retina of 17 d mice

图4　RT-PCR检测17日龄小鼠视网膜中MMP-9mRNA表达Fig.4 mRNA expression of MMP-9was determined by RT-PCR in the retina of 17 d mice

3　讨论

目前临床上主要通过全视网膜激光光凝来抑制RNV的发展，但疗效不是很理想，有导致周围视野和暗视觉丧失等视功能损害的风险［9-11］，因此，亟需新的替代疗法以减轻此类不良反应，细胞表面受体、靶向生长因子和水解蛋白酶等治疗方法应运而生［12-13］。

既往认为高浓度氧是导致ROP的重要原因，而目前研究［14］认为ROP的产生与视网膜的“相对缺氧”有关。制作ROP幼鼠模型时，持续高氧刺激使幼鼠视网膜血管发生可逆性痉挛收缩，小血管闭塞，出现视网膜无灌注区；当幼鼠返回到正常空气环境中，视网膜无灌注区“相对缺血缺氧”，继而出现RNV增生等类似人类ROP的改变［15］。本研究在前期成功构建动物模型的基础上，探讨了MMP-9在ROP模型小鼠RNV形成中的作用，结果显示，高氧组和高氧对照组小鼠视网膜中MMP-9蛋白及基因的表达水平明显上调，提示MMP-9与ROP小鼠RNV的形成密切相关。MMP-9在新生血管形成中可发挥重要作用，但既往的研究多集中于MMP-9与脉络膜新生血管、角膜新生血管的相关性方面，对ROP的研究则相对较少。

GM6001是一种新型的广谱基质金属蛋白酶抑制剂，是已知作用最强的人工合成基质金属蛋白酶抑制剂，对MMP-2和MMP-9均有强大的抑制作用。本研究给予小鼠玻璃体腔内注射GM6001，有效地抑制了ROP中RNV的形成，因而笔者推测缺血缺氧促进了视网膜组织促血管形成因子的释放，激活了MMP-9，加快了视网膜内皮细胞的黏附、迁移和增殖，从而促进RNV形成。而在给予MMP-9抑制剂GM6001后，阻断了MMP-9信号通路，即使促血管生成因子继续存在，也不会发挥下游功能，从而达到抑制RNV形成的作用。

综上所述，本研究组初步判断在缺氧诱发的RNV形成中，MMP-9发挥了一定的作用，通过抑制MMP-9能够抑制RNV的形成。但MMP-9在RNV形成中的具体调节过程如何，涉及哪些信号通路的变化等均不十分明确，有待进一步研究探讨。

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（编辑王又冬）

Expression of MMp-9 in Mice with Oxygen-induced Retinal Neovascularization

DI Yu，YANG Yang，CHEN Xiaolong
（Department of Ophthalmology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To explore the efficacy of GM6001，tissue inhibitor expression and significance of matrix metalloproteinase-9（MMP-9）in mice model of oxygen-induced retinal neovascularization（RNV）and evaluate the inhibition effect of MMP-9 inhibitor（GM6001）on RNV.Methods Mice were placed in oxygen boxes to establish oxygen-induced RNV animal models.The GM6001 treated or hyperxia control groups

an intravitreal injection of 1 μL GM6001（100 μmol/L）or PBS at day 11 after birth.The normal control and hyperxia group were not treated.HE staining was used to detect RNV in retinal whole mounts，the mRNA level and protein expression of MMP-9 were measured by RT-PCR，Western blot and immunohistochemistry，respectively.Results RNV in the GM6001 treated group was decreased significantly compared with the hyperxia group and hyperxia control group.Compared with the normal control group，higher protein and mRNA expression of MMP-9 were observed in the hyperxia group and hyperxia control group.The expression of MMP-9 protein and mRNA were decreased in the GM6001 treated group compared with the hyperxia control group（P＜0.05）.Conclusion The abnormal expression of MMP-9 was closely correlated with RNV.The development of RNV can be markedly inhibited by MMP-9 inhibitor（GM6001），which，we believe，will provide new molecular targets and therapeutic strategy for retinopathy of prematurity treatment.

retinal neovascularization；MMP-9；retinopathy of prematurity

R774.1

A

0258-4646（2016）05-0409-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.05.007

国家自然科学基金（81371045）

底煜（1981-），女，讲师，博士.

陈晓隆，E-mail：chenxl@sj-hospital.org

2015-12-02

网络出版时间：