微核技术在广西宜州城区水质监测中的应用研究

贺庆梅， 王旭彤， 谢彦军， 黄承潇， 杨晓清， 李世标

(1.河池学院　化学与生物工程学院， 广西　宜州　546300； 2.兰州市第五十四中学， 甘肃　兰州　730030)



微核技术在广西宜州城区水质监测中的应用研究

贺庆梅1， 王旭彤2， 谢彦军1， 黄承潇1， 杨晓清1， 李世标1

(1.河池学院化学与生物工程学院， 广西宜州546300； 2.兰州市第五十四中学， 甘肃兰州730030)

通过蚕豆根尖微核技术，对宜州城区不同水源水质进行研究。选取了龙江河宜州城区流域源头、上游、中上游、中游、中下游、下游区段水源，以及废水排放量大的生活废水和缫丝厂废水共8份水样进行微核率影响测试。结果表明，各水样皆受不同程度污染，龙江河宜州城区流域水质污染存在空间差异。其中，源头至中游区段属中度污染，中下游、下游达重度污染，生活废水为中度污染，缫丝厂废水具重度污染。

微核技术；水质监测；污染指数

微核(micronucleus，MN)是真核细胞染色体畸变导致的一种异常结构，主要由于生物受内外环境的遗传毒性诱变后，染色体断裂产生无着丝粒断片或纺锤体受损产生滞后染色体，在细胞分裂时，不能向两极运动，而在细胞浆中独立于主核，形成一个或数个直径小于主核1/3的核小体，其染色性质与主核一致，部分DNA具复制能力，是细胞的一种遗传学终点[1-3]。有小微核和大微核两种形式，通常认为小微核由染色体断片形成，大微核因纺锤体受损造成一条或一组染色体滞后而形成[4]。当外界环境(物理、化学及生物因素)损害作用达一定程度时，可使细胞发生遗传损伤，从而使得微核细胞率(千分率)增加[5]。孟顺龙等研究除草剂阿特垃津对鲫鱼的影响，通过外周血红细胞观察到微核率与诱变剂存在正相关的剂量效应和时间效应[6]。这种根据细胞内微核现象来判断外界毒性因素诱导体内染色体异常的试验方法称为微核技术(micronucleus test, MNT)[7]。该技术简便、灵敏度高，可直接监测环境污染程度，还能评估污染物对生物体拮抗或叠加等综合的生物学效应[8]，这是化学法所不能表现的，因而广泛用于水体污染[9-10]、空气污染[11]、农药污染[12]、辐射危害[13-14]、食品工业[15]、化妆品[16]、医药领域[17]等。微核技术起源于20世纪70年代初Boller和Matter等通过啮齿动物骨髓细胞微核率检测诱变剂活力的研究[18-19]。自建立以来，经不断改进和发展[20]，1982年Degrassi等用蚕豆根尖微核检测淡水中诱变剂的污染，认为该技术准确、快速并适合大批量样品检测等，因而建立了蚕豆根尖微核检测系统[21]。该技术为环境污染特别是水质污染和致突变剂检测研究带来极大便利，1986年我国将蚕豆微核技术引入《环境监测技术规范》的水环境监测中，该技术也是国际规范的监测方法[22]。刘萍等还将蚕豆微核技术与常规水体污染指标进行了相关性比较研究，表明综合评价结果相一致[23]。

龙江河属珠江水系西江支流柳江的最大支流，是宜州市境内最大的河流，也是主要水资源，其水环境状况影响当地居民的生活及产业发展。因其流经南丹、环江、金城江等地，而这些地区皆有许多正在开采的矿山，其水质极易受重金属等污染。2012年，龙江河发生的罕见镉浓度严重超标事件，引起社会高度关注，镉等重金属污染不仅影响当地的生态环境,更威胁居民的生活健康及生产[24]；2014年龙江河再次重金属含量超标，令龙江河下游群众大为不安[25]。因此迫切需要对龙江河水质进行定期监测。利用蚕豆微核技术对龙江河宜州城区流域水质，宜州城区缫丝厂废水和生活废水水质的检测，能够从生物学角度综合评估宜州城区水质的状况，对掌握宜州城区水体环境及水质动态变化具有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料

青皮蚕豆(安徽阜阳市售)。

1.2方法

1.2.1样点选择与水样采集

(1)龙江河广西宜州城区流域由西向东依次按源头(龙A)、上游(龙B)、中上游(龙C)、中游(龙D) 、中下游(龙E) 、下游(龙F)六个区段分别取样，其采集地标分别为：龙A(E 108.561°，N 24.529°)，龙B(E 108.624°，N 24.505°)，龙C(E 108.640°，N 24.502°)，龙D(E 108.656°，N 24.499°)，龙E(E 108.666°，N 24.497°)，龙F(E 108.672°，N 24.496°)，皆无臭味；

(2)宜州城区某缫丝厂废水(E 108.604°, N 24.502°)，恶臭；

(3)宜州城区生活废水(E 108.660°，N 24.502°)，微臭味。

水样采集时间为2015年5月，用棕色试剂瓶各采集500 mL，带回实验室后立即使用。

1.2.2对照设置

阳性对照：0.5 g/L重铬酸钾溶液。

阴性对照：蒸馏水。

1.2.3蚕豆萌发

选取颗粒饱满，大小一致的青皮蚕豆于恒温培养箱25 ℃条件下用蒸馏水浸泡约24 h，期间换水2次(用于更换的蒸馏水同放恒温培养箱中预热)，待其充分吸胀后，选取种孔开裂的青皮蚕豆平铺于两层湿润脱脂棉纱布中层进行催芽，每隔12 h换水1次。约24 h后进行一次筛选，选取初生根长势一致(约2.5 mm)的青皮蚕豆继续催芽，约48 h后，初生根长至1.5～2 cm，根毛发育良好。

1.2.4蚕豆根尖处理

将初生根长势一致的青皮蚕豆，随机分装至10面培养皿中，每面15颗。将8个待测水样及2个对照处理水样摇匀后分别倒入培养皿，以蚕豆根尖浸没即可。扣上培养皿盖后放入盛水托盘，再用湿润脱脂棉纱布盖住培养皿，边缘浸没于托盘水中，以防处理液蒸发。于25 ℃恒温培养箱中处理24 h后，用蒸馏水浸洗3次，每次4 min，再于25 ℃蒸馏水中恢复培养24 h便可进行取材固定。

1.2.5蚕豆根尖微核检测

剪取1 cm根尖，置于5 mL离心管中，用卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定24 h，期间换固定液2次，之后移入70%乙醇中(暂不进行制片的可于4 ℃保存)。随机抽取每个处理中固定好的蚕豆根尖9个(每个重复取三个根尖，每个处理三个重复，取平均值)，用去离子水浸洗2次，每次5 min ，吸净蒸馏水后加6 mol/L盐酸于室温酸解20 min，待幼根软化方可弃去盐酸(用滤纸吸净)，用蒸馏水浸洗3次，每次2 min。截取2 mm根尖于载玻片滴加改良苯酚品红染液[26]，染色15 min后换以蒸馏水，先用解剖针将根尖撕碎，加盖玻片(再盖上一小块滤纸利于敲打)，垂直轻敲盖玻片进行压片。最后将制好的装片于显微镜成像系统(OLYMPUS BX51，40×10)镜检，每个重复约1 000个细胞(每个根尖随机拍照5张，每个重复3个根尖共15张照片)，记录微核细胞数。

1.3数据统计及分析

微核率(MN)‰=有微核细胞数/总观察细胞数×1000 ‰

污染指数(PI)=样品实测MN‰平均值/去离子水(阴性对照)MN‰平均值

据《全国生物技术检测规范—蚕豆根尖微核技术》规定，以PI值划分受污染程度[27]，划分标准见表1。

表1　污染指数(PI)评价水质标准

注：数值在上、下限时定为上一级污染。

不同水样处理蚕豆根尖微核率的影响采用Microsoft Excel 2007作折线图分析，方差分析和多重比较采用SAS9. 0软件，Bon法[28]进行统计。

2　结果与分析

2.1不同水样处理对蚕豆根尖细胞生长的影响

蚕豆根尖细胞经各水样处理皆可镜检到微核现象存在，各产生微核情况不同，处理结果明显，见图1。

图1　不同水样对蚕豆根尖微核诱变的显微观察a.无微核； b.小微核； c.大微核； d.双微核

2.2水样受污染程度统计

表2　水样受污染程度统计

由表2各可知，各水样皆受不同程度污染。龙江河宜州城区流域水环境整体受污染，其源头(龙A)即属中度污染，中下游及下游区段(龙E和龙F)受污染程度达重度污染，其余区段皆受中度污染。生活废水可带来中度污染，缫丝厂废水能造成重度污染。

2.3龙江河宜州城区流域不同区段水质对蚕豆根尖微核率的影响

图2　龙江河宜州城区流域不同区段水样对蚕豆根尖微核率的影响

由图2可知，龙江河宜州城区流域各采样点水质对蚕豆根尖微核率的影响顺水流方向趋势逐步升高，表明龙江河水体受宜州城区的污染作用，且存在空间差异，因龙江河流经宜州城区中央而过，沿途接受城区排放的所有废水。其源头至中游区段微核率有微弱降低趋势，但中游至下游区段微核率表现较明显的增加趋势。这是由于城市废水污染的富集作用，加之源头已受中度污染，致使污染程度迅速增强，最终造成龙江河宜州城区流域水环境受到严重污染。

2.4各水样对蚕豆根尖微核率影响的多重比较

表3　不同水样对蚕豆根尖微核率影响的多重比较

注：表中数据为(平均值 ± 标准差)，小写字母代表0.05 水平，大写字母代表0.01水平。

由表3可知，不同水样对蚕豆根尖微核率的影响存在差异。皆与阴性对照(无污染)差异达极显著水平(F﹤0.01，p﹤0.01)；缫丝厂废水与龙江河宜州城区流域下游区段水质污染程度与阳性对照(重度污染)无极显著差异，表明这两种水样重度污染程度相当严重，其次受重度污染的是龙江河中下游区段水体。龙江河宜州城区流域源头至中游区段整体受污染程度存在差异但未达极显著水平，其中污染程度最低的中上游及中游区段所受污染水平与直接排放的生活废水相当，表明龙江河整体水环境受较高程度污染。

3　讨论

城市离不开赖以生存的水资源。城区的生活、工农业等无不得益于河流而发展，穿城而过的江河受到城市的作用导致水质改变，因此城市与江河互为影响。而城市如果忽略可持续发展，往往对江河污染带来重创甚至不可逆。2012年龙江河宜州市境内曾发生的镉浓度严重超标事件[24]。在拉浪水电站前方200m处，镉含量超标约80倍，被专家称为“世界罕见”。当地政府采取投放石灰粉和聚合氯化铝的措施，利用镉离子在碱性条件下形成难溶的氢氧化镉沉淀而去除水中镉含量，但相关专家还是提出了质疑，表示重金属污染能导致在环境里永远循环无法降解，并具富集性，是不可逆转的[29]。2014年龙江河镉污染事件再次爆发，镉、锌浓度分别超标8倍和9倍[25]。表明龙江河易受重金属污染，龙江河发源于贵州，沿途皆为喀斯特地貌，流经多个重金属厂矿地区，在尚未进入城区的源头A位点水质已属中度污染。

生活废水主要污染源为排泄物、洗涤剂等。李宗芸等[30]通过8种家用洗洁精对蚕豆根尖毒性效应的研究发现6种洗洁精浓度在0.1%时可使得蚕豆根尖细胞微核率显著上升，浓度在1%～10%时8种洗洁精皆可使蚕豆根尖发黑，初生根变形，表明洗涤用品可污染水源，并且生活废水中富含有机质的排泄物可使有害微生物增生等，对河流具一定污染作用。本试验生活废水水质检测结果为中度污染。

蚕丝加工过程中，缫丝和汰头等是产生废水的环节。缫丝耗水量大，汰头废水含丰富蛹油等高分子有机物，腐败发酵产生恶臭，被缫丝厂作为废水排放，大量消耗河道溶氧，破坏水质，造成污染[31]。有学者研究出酸碱水解法[32]、A2O+滤布滤池工艺[33]、NaOH改性杉木屑处理[31]等方法能有效处理缫丝厂废水。宜州是国内最大的桑蚕生产县级市，蚕丝加工废水量大。本次取样检测出重度污染，需引起重视，应加以充分处理后排放，以降低对城区环境及龙江河水源的污染。

由于宜州城区生活废水、工业及医院等废水排放的富集作用终于导致龙江河宜州城区中下游至下游区段重度污染。

4　结论

通过蚕豆根尖微核技术能有效的监测宜州城区水质情况，对实时掌握宜州城区水质、江河水体环境及动态变化具有可实践意义。

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[Abstract]Vicia-micronucleus test was applied to monitor the water quality of Yizhou city. 8 water samples were selected from the headwater, upper reaches, upper and middle reaches, middle reaches, middle and lower reaches, lower reaches of Longjiang River’s Yizhou city basin, and from the domestic wastewater and silk factory wastewater which discharge a large amount of wastewater. The micronucleus rate was monitored for the 8 water samples. The results show that all the water samples were polluted to different degree. The pollution of Longjiang River’s different sections has spatial variability. The headwater to middle reaches are under moderate pollution; the middle and lower reaches, lower reaches are heavily polluted; domestic wastewater is under moderate pollution; the silk factory wastewater suffers from heavy pollution.

[Key words]micronucleus test； water quality； pollution index(PI)

[责任编辑刘景平]

Utilization of Micronucleus Test to Monitor the Water Quality of Yizhou City

HE Qing-mei1， WANG Xu-tong2， XIE Yan-jun1， HUANG Cheng-xiao1，YANG Xiao-qing1, LI Shi-biao1

(1.College of Chemical and Biological Engineering, Hechi University, Yizhou, Guangxi 546300，China;2. No.54 Middle School of Lanzhou， Lanzhou, Gansu 730030，China)

X522

A

1672-9021(2016)02-0017-06

贺庆梅(1985-)，女，江西吉安人，河池学院化学与生物工程学院讲师，主要研究方向：植物修复与植物资源利用。

河池学院环境工程专业硕士点建设学科资助项目(2015HJB008)。

2016-01-11