镍离子对人血管内皮细胞增殖影响的研究*

韦乐华，孙婧媛，任慧文，刘健博，高与远，李黎明

(东北大学生命科学与健康学院生物技术研究所，辽宁　沈阳　110819)



镍离子对人血管内皮细胞增殖影响的研究*

韦乐华，孙婧媛，任慧文，刘健博，高与远，李黎明

(东北大学生命科学与健康学院生物技术研究所，辽宁沈阳110819)

探索了镍离子对人血管内皮细胞增殖的影响。本研究以人脐静脉内皮细胞为研究对象，从细胞生长活性、细胞形态等几个方面入手，运用MTT、姬姆萨染色等方法探索不同浓度的镍离子对血管内皮细胞增殖的影响。通过研究发现，氯化镍对人脐静脉内皮细胞的半数致死浓度为260 mg/L。在镍离子作用下，HUVEC细胞增殖受到抑制，细胞形态有中毒样改变，在观察浓度及时间范围内，呈现浓度依赖和时间依赖趋势。

镍离子；血管内皮细胞；细胞增殖；细胞毒性

冠状动脉内植入支架治疗自20世纪80年代中期临床应用以来，得到了迅速的发展，已成为治疗动脉粥样硬化的主要方法之一。目前在临床使用的金属支架材料中，主要为316L不锈钢、钴铬合金L605和NiTi合金等，其通常含有10%～14%的镍元素[1]。

镍是一种潜在的致敏因子，镍及其化合物对人类最常见的损害是镍接触性皮炎。同时，早在20世纪30年代，就发现长期接触镍使癌症发病率较高。同时镍的毒性和致癌性还与其催化羧基、过氧化氢、氧气等物质产生自由基有关[2]。医用金属材料植入人体后，与血液发生直接接触，所以支架的腐蚀会导致金属离子释放到临近的组织中。

有研究表明，不锈钢支架中镍离子的释放会导致过敏和再狭窄，而内皮细胞可以在血管腔的表面形成一个抗凝血和抗血栓系统，维持血液在血管中的正常流动的支架上的内皮细胞有利于减轻和修复支架置入后损伤的血管内皮，弱化诱发再狭窄的始动因素，避免金属支架与血流直接接触，使血流平稳，减少不良刺激，从而减轻细胞增殖引起的支架内再狭窄和术后血栓的形成[3]。

本研究通过模拟体内支架材料对血管内皮细胞的影响，即模拟镍离子析出，观察不同浓度的镍离子对血管内皮细胞的影响。主要从细胞生长、形态、细胞毒性等几个方面探索不同浓度的镍离子对血管内皮细胞的影响。通过本研究，可以更深入地探讨位于体内的支架材料的镍离子析出对于血管内皮细胞的影响，从而为金属支架的设计制造和优化提供理论依据。

1　实　验

1.1材料和试剂

实验所用细胞为人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)，购于南京凯基生物科技发展有限公司；实验用标准胎牛血清、RPMI-1640培养基、姬姆萨染液以及MTT，均购于国内生物公司。

1.2细胞培养

HUVEC用RPMI-1640培养基培养，添加10% 标准胎牛血清(TBD)和1%的青链霉素，置37 ℃，5%CO2培养箱中培养。

1.3细胞形态观察

取对数生长期细胞，接种至24孔培养板中，细胞数目为2×104。设对照组和实验组，对照组加入新鲜的细胞培养液，实验组则加入不同浓度的氯化镍培养液使得终浓度为7.813、15.625、31.25、62.5、125、200、250、400、500 mg/L。相同条件下继续培养24 h、48 h、72 h后分别取出弃去培养液，加入 PBS清洗2次。用4%的多聚甲醛固定，然后加入姬姆萨溶液染色15 min。在倒置显微镜下观察不同药物浓度下的细胞形态并拍照[8]。

1.4MTT测定细胞相对增值率

取对数生长期细胞，接种至96孔培养板中，细胞数目为4×103个细胞，终体积为100 μL。设空白组和实验组，空白对照组加入新鲜的细胞培养液，实验组加入不同浓度的氯化镍培养液，使得终浓度为7.813、15.625、31.25、62.5、125、200、250、400、500 mg/L[4-5]。每个实验组设5个复孔。在37 ℃恒温培养箱中继续培养24 h后，加入MTT溶液(5 mg/L) 20 μL再继续培养4 h。吸出孔内液体，每孔加入DMSO 150 μL。使用酶联免疫检测仪在550 nm处检测各孔的吸光值。致死率计算，致死率=(对照组吸光度值-实验组吸光度值)/对照孔吸光度值×100%。根据致死率和浓度关系做出致死曲线，通过线性关系得出半数致死浓度[6-7]。并计算细胞相对增值率(relative growth rate，RGR)，计算公式为：RGR=(实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。实验重复3次。可根据RGR值，按照其与材料毒性级别的对应关系对结果进行分级。

1.5统计学方法

实验数据以均数(x±s)标准差表示。采用SPSS 进行统计分析，P<0.05为有统计学意义。

2　结果与讨论

2.1镍离子对血管内皮细胞形态的影响

图1　不同浓度的镍离子在不同时间下对细胞形态的影响

经不同浓度镍离子分别处理24 h、48 h和72 h后，通过姬姆萨染色观察HUVEC的细胞形态(图1)。对照组细胞贴壁生长状态良好，细胞排列规则密集。从细胞数量上看，随着镍离子浓度的升高，细胞的数量逐渐减少。细胞逐步呈现中毒状态，活细胞比例降低，细胞胞体变小，成固缩状态，贴壁能力下降。从作用时间上看，随着镍离子作用时间的延长，细胞在结构上逐渐呈现固缩的趋势，细胞形态逐渐由细胞形态不规则到细胞固缩，细胞膜破裂，细胞质消失，直至仅剩下细胞核。

2.2镍离子对血管内皮细胞的半数致死浓度

图2　血管内皮细胞在不同镍离子浓度下的抑制率

镍离子对HUVEC的抑制率如图2所示，可看出镍离子与抑制率在一定范围内为线性关系，将该线性关系拟合后得出公式：y=0.0019x+0.0066，其中R2=0.9916，可见镍离子浓度在62.5～400 mg/L之间与抑制率具有十分良好的线性关系，由此公式可计算出24 h时氯化镍对人脐静脉内皮细胞的半数致死浓度为260 mg/L。

2.3镍离子对血管内皮细胞增殖的影响

表1　血管内皮细胞在不同时间和不同镍离子浓度下的相对增殖率

图3　血管内皮细胞在不同时间不同镍离子浓度下的相对增殖率

级别相对增殖率/%0≥100180～99250～79330～4940～29

表3　血管内皮细胞在不同时间和不同镍离子浓度下的细胞毒性级别

根据各不同镍离子浓度组的细胞相对增殖率，依据细胞毒性评价标准(表2)对各组结果进行分级(表3)。根据结果可以看出，除对照组外，其余各浓度组均表现出细胞毒性，且随着浓度的增加及作用时间的延长，相应的细胞毒性等级也出现增加的趋势。当镍离子浓度较高时400 mg/L及500 mg/L，细胞的毒性等级集中于3～4级，均表现出较强的细胞毒性。当镍离子浓度不大于15.625 mg/L时，细胞毒性均不大于1级，当镍离子浓度为31.25 mg/L及以上时，所有细胞毒性级别均为2级以上。

3　结　论

本研究从细胞生长活性、细胞形态和细胞毒性等几个方面入手，运用MTT、Giemsa染色等方法了观察了不同浓度的镍离子对HUVEC细胞增殖的影响。

目前许多研究表明，在介入治疗过程中存在着内皮细胞的损伤。而且还有学者针对该损伤提出了“内皮损伤—反应”学说并得到广泛的支持，该学说认为动脉粥样硬化是动脉壁对血管内皮损伤所作出反应的结果，导致动脉粥样硬化的各种危险因素，最终都是通过不同途径损伤动脉内膜。

通过对HUVEC细胞形态的观察发现，在不同浓度的刺激下，细胞形态和亚结构均出现不同程度的损害，如细胞回缩、胞浆空泡性改变、线粒体肿胀和细胞核形态不规则等改变，且随着浓度的增大，破坏更加明显[9]。

MTT法是日前常用的细胞毒性评价方法，其吸光度值大小可反应活细胞数量的多少及细胞代谢活性的强弱。由结果分析可得，镍离子对HUVEC细胞增殖活力具有明显抑制作用，随着浓度增加，时间延长，活细胞数量大幅减少。评价金属离子的细胞毒性通常根据TC50，即可导致细胞半数死亡的离子浓度。对于HUVEC细胞，通过MTT实验，可以得出氯化镍对HUVEC的TC50值大约为260 mg/L，此结果与前人的研究结果相一致[10]。而且随着镍离子浓度的增加，镍离子对HUVEC的抑制率越高，并且在一定镍离子浓度范围内呈现出线性趋势，同时随着作用时间的延长，镍离子对HUVEC的抑制率也逐渐上升。

本实验发现，随着镍离子浓度的增加，作用时间的延长，HUVEC细胞增殖受到明显的抑制。提示时间和浓度是镍离子细胞毒性效应的两个重要指标。在对镍离子的细胞毒性进行评价时，需综合考虑以上两种因素的影响。

镍离子溶出是使用含镍支架的一个不可回避的问题，本研究观察了镍离子对HUVEC细胞增殖的影响。本研究仅从细胞增殖和细胞形态的改变对镍离子的细胞毒性作一评价，全面认识镍离子的细胞毒性仍需从机制角度进行进一步探讨。

[1]任尹宾, 杨柯, 梁勇. 医用金属材料中的镍危害[J]. 生物医学工程学杂志, 2005,22(5):1067-1069．

[2]刘静, 程宁. 镍化合物细胞毒理学研究的某些进展[J]. 工业卫生与职业病, 2010,36(5):306-308．

[3]张海燕. 血管支架致血管再狭窄的体外实验研究[D]. 成都:西南交通大学, 2006．

[4]Taira M, Toguchi M S, Hamada Y, et al. Studies on cytotoxic effect of nickel ions on three cultured fibroblasts[J]. Materials In Medicine, 2001, 12(5):373-376.

[5]Cortijo J, Milara J, Mata M, et al. Nickel induces intracellular calciummobilization and pathophysiological responses in human cultured airway epithelial cells[J]. Chemico-Biological Interactions, 2010, 183(1): 25-33.

[6]Ahamed M, Akhtar M J, Siddiqui M A. Oxidative stress mediated apoptosis induced by nickel ferrite nanoparticles in cultured A549 cells[J]. Toxicology, 2011, 283(2-3): 101-108.

[7]Ahamed M. Toxic response of nickel nanoparticles in human lung epithelial A549 cells[J]. Toxicology in Vitro, 2011, 25(4): 930-936.

[8]Laine L, Lewin D N, Naritoku W, et al. Prospectivecomparison of H&E Giemsa and Genta stains for the diagnosis of Helicobacterpylori[J]. Gastrointest Endosc, 1997, 45(6): 463-467.

[9]王琛, 夏露, 陈亚明. 镍离子对小鼠成纤维细胞毒性的实验研究[J]. 口腔医学, 2012,32(4):226-229．

[10]张贵, 程彩霞, 祁凤君, 等. 镍对体外培养内皮细胞的影响[J]．现代生物医学进展, 2010,10(2):224-228．

Study on Influence of Nickel Ions on the Proliferation of Vascular Endothelial Cells*

WEILe-hua,SUNJing-yuan,RENHui-wen,LIUJian-bo,GAOYu-yuan,LILi-ming

(College of Life and Health Sciences, Northeastern University, Liaoning Shenyang 110819, China)

The influence of nickel ions on the proliferation of HUVEC cells (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) was evaluated. MTT and Giemsa stein were used to assess the cell viability and cell morphology under different concentrations of nickel ions. According to our research, the lethal dose 50 of Nickel Chloride was 260 mg/L. Inhibition rate increased with the increasing of concentrations of nickel ions and also increased with the time exposure to nickel ions. Ultrastructural alterations were observed including irregular shaped nuclei and the phenomena were dose dependent. Cellular proliferation of HUVEC was obviously inhibited by nickel ions. Cellular morphology of HUVEC became to be toxic state, and that was dose dependent and time dependent．

nickel ions; vascular endothelial cells; cell proliferation; cytotoxicity

辽宁省博士启动基金(No。20141010);中央高校基本科研业务费(N152004001)。

李黎明(1977-)，女，博士，主要从事生物材料方向的研究。

TH142.2

A

1001-9677(2016)010-0070-03

共同第一作者：韦乐华，孙婧媛。