维生素C含量检测实验的改革

赵玉红， 李　欣， 崔建林， 周　浩， 李登文， 张金红， 赵立青

(1. 南开大学 生物实验教学中心, 天津　300071； 2. 南开大学 医学院, 天津　300071)



维生素C含量检测实验的改革

赵玉红1， 李欣1， 崔建林2， 周浩1， 李登文1， 张金红1， 赵立青1

(1. 南开大学 生物实验教学中心, 天津300071； 2. 南开大学 医学院, 天津300071)

为培养学生科学系统的思维方式、提高数据分析能力,对本科生物化学实验教学中“维生素C的含量检测”实验进行改革与创新。在保留传统的2,6-D滴定法基础上,新增了高效液相色谱分析方法的部分内容。采用C18色谱柱,流动相为0.1%草酸,流速为1.0 mL/min,进样量为20 μL,检测波长为255 nm,外标法定量。结果显示:维生素C(Vc)在5～100 μg/L内有良好的线性关系(R2=0.999 5),每100 g猕猴桃中Vc含量为95.47 mg。通过对同一实验多角度开展研究,使学生深入掌握生物化学研究中常用的定性与定量方法,培养学生对数据进行合理的统计与分析能力。

维生素C; 含量检测； 高效液相色谱

维生素C(Vc)又称抗坏血酸,是维持机体正常生命活动所必需的小分子有机化合物。人体自身不能合成Vc,必须从食物、药物中摄取,因此食品、药物中Vc的分析与测定具有重要意义[1]。Vc含量的检测方法有很多,传统的有2,6-二氯酚靛酚(简称2,6-D)滴定法[2-3]、比色法[4-5]、荧光法[6-7]等。随着科学技术的快速发展,近年来,已有不少文献报道利用高效液相色谱法(简称HPLC)测定Vc的含量[8-12]。“维生素C的含量检测”是目前高等院校生化基础实验教学中普遍开设的一个实验项目,常以水果、蔬菜为原材料,采用2,6-D滴定法。

学生在进行生化实验中,不仅要接触到各种实验现象,而且获得了大量的数据,因此培养学生对数据进行合理的统计与分析,成为生化实验教学中不可或缺的环节[13]。为了加强学生的数据分析能力,培养科学系统的思维方式,结合现有的“维生素C的含量检测”实验特点,在保留传统的2,6-D滴定法基础上,利用中心仪器平台的2台高效液相色谱仪,并新增了HPLC这一科研与实际生产中广泛使用的定性与定量分析方法。

1　主要仪器、试剂与材料

仪器:CoM高效液相色谱仪(配紫外检测器),电子天平等。

试剂与材料:Vc标准品购自天津市化学试剂研究所(分析纯),草酸购自天津市化学试剂供销公司(分析纯),ddH2O，猕猴桃样品为市售。

2　实验方法

2.1样品前处理

根据参考书《生物化学实验习题集》[14],称取2.0 g猕猴桃,加入3～5 mL、1%草酸研成浆状后转移至50 mL容量瓶中,定容,混匀后,滤纸过滤。滤液经0.45 μm滤膜过滤,供HPLC分析用。

2.2Vc标准溶液的制备

精确称取0.01 g Vc标准品,置于10 mL容量瓶中,加10 mL、0.1%草酸溶解,制得质量浓度为1 g/L的Vc标准储备液。分别吸取一定量的Vc标准储备液,用1%的草酸溶液稀释制得质量浓度分别为100、80、50、25、5 mg/L的标准工作液,0.45 μm滤膜过滤,备用。Vc标准储备液及工作液现用现配。

2.3色谱条件

色谱柱:C18柱(250 mm×4.6 mm)，流动相为0.1%草酸，流速为1 mL/min，检测波长为255 nm，进样量为20 μL。

3　结果与分析

3.1标准溶液和样品色谱图

分别取Vc标准溶液和样品液按2.3节的色谱条件进行测定,测得的色谱图分别见图1和图2。结果显示,标准溶液中Vc保留时间t为7.418 min,猕猴桃样品中Vc保留时间为7.427 min,保留时间基本一致,分离效果好且峰形对称,可用于定量检测。由于水果中色素等杂质的影响,在猕猴桃中Vc峰之后还有3个小的杂质峰,保留时间依次为11.303 min,18.015 min,28.352 min。

图1　Vc标准工作液的HPLC色谱图

图2　猕猴桃样品中Vc的HPLC色谱图

3.2方法的线性范围

将2.2节制备的Vc标准溶液依次进样,记录色谱图及峰面积响应值,以Vc浓度c(Vc)为横坐标,相对峰面积S为纵坐标,建立标准工作曲线,如图3所示。回归方程为y=19 345x+16 835,R2=0.999 5,结果表明Vc在5～100 mg/L浓度范围内线性关系良好。

图3　维生素C的标准曲线

3.3猕猴桃中Vc的含量测定

取经2.1节方法处理过的猕猴桃样品滤液,进样,记录色谱图。经计算,每100g猕猴桃中Vc含量为95.47mg。

4　讨论

4.1选材及样品前处理

HPLC法所采用的实验材料及样品前处理方式与传统的2,6-D滴定法完全一致,即称取一定量的猕猴桃加入1%草酸研磨,定容,过滤。预实验结果及相关文献报道[15]表明,Vc在酸性溶液中6 h内较为稳定,无显著变化,可用于定量分析。因此学生可在2,6-D滴定法检测完后,直接取少量样品滤液经0.45 μm滤膜过滤,即可进行HPLC检测。这样的选材及样品前处理方式具有以下优点:

(1) 简便、易行,因猕猴桃自身色素条件,不需要进行脱色处理,即可进行2,6-D滴定法和HPLC检测,Vc损失少且不需要学生重复处理样品；

(2) 可在有限的课时资源里扩大课程的知识量,经典与前沿分析方法相结合,多角度拓展学生思维；

(3) 利于学生对同一样品、不同检测方法得出的实验结果进行比较、分析。

4.2课程设计

基础实验课都有一定的课时限制,课程组通过大量的预实验,对色谱条件进行优化,确定了最佳的检测方案，并通过方法学考察验证了该方案的可靠性。实验课上学生只做标准工作曲线以及样品检测实验,教师先将2台HPLC仪器调试好,将Vc标准品课前准备好,由实验完成速度快的几名学生来完成标准品的检测,每台仪器出一组标准品数据。其他学生完成2,6-D滴定法检测后,直接拿自己的样品进样即可。根据图2样品的色谱图结果,每个学生进样时间控制在11 min左右,在排除杂质干扰、不影响峰面积响应值的情况下,尽量缩短Vc检测时间。实验的间隙,为学生普及HPLC的工作原理、应用、注意事项、样品前处理以及方法学中相关概念等知识。

4.3数据分析

在“维生素C的含量检测”实验教学中,需要对大量的实验数据进行进行统计分析。

(1) 传统的2,6-D滴定法。每个样本设定了3个平行重复,学生可以通过求平均值、方差和标准差,分析实验误差的大小。

(2) 高效液相色谱法。学生通过Excel等软件绘制标准曲线并建立线性回归。由于课时限制,方法学中的精密度、重复性、稳定性、回收率等实验在实验课上没有时间进行,缺少这部分数据。鉴于HPLC实验的完整性、系统性,方法学实验不可或缺,为弥补这部分缺憾,通常教师将预实验时所得的相关峰面积数值告诉学生,学生带着已知数据课后进行方法学分析。

4.4课后思考题

为使学生充分内化吸收两种分析方法的原理与研究思路,课后布置思考题,思考结果在实验报告里得以体现。如:

(1) 为准确测得Vc的含量,实验时要注意哪些操作步骤？

(2) 如何选择样品的不确定度才能使测试结果的准确性接近真实？

(3) 需要获得哪些有用的数据信息用以支撑所测得结果的科学有效等？

生物化学实验课程的授课对象为大二年级的本科生,他们在大一年级都学过分析化学,有一定的基础。对通过实例获得的大量实验数据进行分析、归纳、总结,由繁入简,由简入繁,利于学生形成科学系统的思维方式,为今后从事科研工作打下坚实的基础。

5　结语

通过色谱条件的优化和合理的课程设计,将HPLC这一先进的分析技术与经典检测方法在同一实验项目中同时呈现,使学生综合掌握生物化学研究中常用的定性和定量方法。目前很多高校配备了高效液相色谱仪,且大多在生化基础实验课中开设了“维生素C的含量检测”实验,改革后的实验需要学生课后对所得到的大量数据做出合理的统计与分析,以得出科学可靠的结论,这对于提高学生的数据分析能力,培养学生科学系统的思维方式方面有着积极意义,值得推广。

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Reform of experiment about content determination of Vitamin C

Zhao Yuhong1, Li Xin1, Cui Jianlin2, Zhou Hao1, Li Dengwen1, Zhang Jinhong1, Zhao Liqing1

(1. Biological Experimental Center,Nankai University,Tianjin 300071,China;2. College of Medicine,Nankai University,Tianjin 300071,China)

In order to cultivate the students’ mode of thinking and improve the data analysis ability,the experiment about determination of Vitamin C has been reformed in the teaching of biochemistry experiment. High performance liquid chromatography method was added while 2,6-D titration method was retained . The separation was conducted on C18 column with 0.1% oxalic acid as mobile phase.The flow rate was 1.0ml/min.The sample size was 20 μL. The detection wavelength was 255nm. The external standard method was used. The results show that vitamin C haS a good linear relationship (R2=0.999 5) in 5—100 μg/L,and the content of Vc was 95.47 mg/100 g. Through the study on the same experiment, the students have mastered the qualitative and quantitative research methods commonly used in biochemistry, and improved the ability of reasonable statistics and analysis on the data.

Vitamin C； content determination; high performance liquid chromatography

DOI:10.16791/j.cnki.sjg.2016.06.017

2015-12-15修改日期:2016-01-26

国家基础学科人才培养基金“条件建设项目”(J1310003)；南开大学2014年教学改革项目

赵玉红(1981—)，女，山东青岛，硕士，实验师，从事生物化学和分子生物学实验教学工作

E-mail:zyh@mail.nankai.edu.cn

赵立青(1962—)，女，云南洱源，博士，教授，从事蛋白质结构与功能研究以及基于蛋白质结构的工程应用.

E-mail:lqzhao@nankai.edu.cn

Q5-33

B

1002-4956(2016)6-0063-03