VEGF、KDR在精索静脉曲张大鼠睾丸中的表达意义

马 莉，艾庆燕（延安大学医学院，陕西 延安 716000）

VEGF、KDR在精索静脉曲张大鼠睾丸中的表达意义

马 莉，艾庆燕
（延安大学医学院，陕西 延安 716000）

摘要：目的 研究VEGF及KDR在实验性左侧精索静脉曲张4周组及8周组大鼠睾丸中的表达变化，探讨它们与精索静脉曲张（VC）的关系及VC致男性不育的病理生理学机制。方法建立大鼠实验性左侧精索静脉曲张模型，于术后4周和8周取双侧睾丸，采用免疫组织化学SP法检测VEGF、KDR在实验组和对照组SD大鼠睾丸上的表达情况。结果 ELV 4周组大鼠两侧睾丸中VEGF蛋白表达均上调，8周组表达均下降；ELV4周组大鼠睾丸中KDR蛋白的表达与对照组比较显著增强，而8周组比对照组和4周组均显著降低。结论VEGF和KDR在睾丸中的表达明显受到ELV进程的影响，说明它们在VC致男性不育中起到一定的作用。

关键词：透射式；脉率；血氧饱和度；光电容积脉搏波

[CLC Number] R394.1; R318.16[Document Code] ADOI: 10.11967/2016140309

英国外科医生BARFIELD 首先提出精索静脉曲张（varicocele， VC ） 可造成男性不育，VC是导致男性不育的常见疾病，在男性不育症中占很大比例。VC也是一种血管性疾病，以精索内蔓状静脉丛呈不同程度扩张、伸长和迂曲为特点［1］。大量临床和实验证明，VC时某些细胞因子可造成睾丸损伤，以至于干扰了精子的发生和成熟而致不育。目前，关于VC 导致不育的细胞分子病理机制取得了很大进展，主要包括生精细胞凋亡异常和氧化应激［2］两方面。笔者等前期有研究表明，血管内皮生长因子（ vascular endothelialgrowth factor，VEGF） 及其受体2（KDR）可能参与了精子的发生和成熟的调控过程，但他们如何调控雄性生殖以及他们与VC不育的相关性还未完全阐明。故本研究通过建立青春期大鼠实验性左侧精索静脉曲张（ experimental left varicocele， ELV ）模型，采用免疫组化技术检测VEGF和KDR蛋白在ELV4周和8周组睾丸中的表达变化，探讨VEGF和KDR与精子发生的关系以及在VC 中的可能作用，为VC所致不育的可能机制的研究提供一些实验资料。

1　材料与方法

1.1建模

购买SD 雄性大鼠40只，鼠龄大约6-7周，体重150-190 g（购买于北京芳元缘动物养殖场）。将大鼠随机分为两组，然后分别建立ELV4周组和8周组，也设假手术组作为对照。

1.2处理标本

分别于术后4 周及8 周麻醉大鼠，剖腹取ELV组及对照组双侧睾丸组织（以左侧精索静脉比术前扩张2倍以上，且双侧肾脏大小相当为建模成功，除2只静脉曲张不明显外，其余皆建模成功）。所有标本经新鲜配制的Bouin's液固定后常规石蜡包埋，切片4-5 μm。

1.3试剂、方法及结果的判定

兔抗鼠多克隆VEGF、KDR抗体、SP-9001染色试剂盒与DAB显色液均购自于北京荣兴生物技术有限公司。采用SP法进行免疫组化染色：组织标本脱腊至水后，修复抗原采用枸橼酸缓冲液微波修复，3%双氧水可以消除内源性过氧化物酶，TritonX-100浸泡可以增加组织的可穿透性，其他步骤严格按照试剂盒说明进行。以0.01 mol/LpH（7.0-7.4）PBS液代替一抗作为阴性对照。用日本Olympus I71型显微镜下观察，以细胞中出现棕黄色颗粒为阳性，每张切片随机选取至少5个视野拍照，然后用图像分析仪测量灰度值，比较各组灰度值差异，灰度值越低表示免疫反应阳性越强。

1.4统计分析

数值结果以Mean ±SD表示。运用SPSS 13. 0统计软件进行单因素方差分析（ one-way ANOVA），检验水准α = 0. 05。

2　结果

本研究采用青春期ELV大鼠模型，是目前国内外公认的理想的疾病模型，建模成功后取睾丸组织，采用免疫组化法发现VEGF和KDR蛋白在正常及ELV大鼠的睾丸组织中都有表达。VEGF与 KDR阳性表达均呈棕黄色颗粒，在对照组与实验组睾丸生精上皮内可见阳性产物。VEGF和KDR蛋白在正常大鼠睾丸中的定位可见笔者前期论文［3］，免疫组化显示VEGF和KDR在实验组大鼠睾丸中也有表达（如图），但对其表达水平进行图像分析显示，ELV 4周组大鼠左（图2）、右侧睾丸中VEGF蛋白的表达水平与对照组（图1）比较均显著增加（p＜0.01，p＜0.01），左侧组表达量显著高于右侧组（p＜0.01）；ELV8周组左（图3）右侧睾丸VEGF蛋白的表达量下降（p＜0.01，p＜0.01），8周组表达量显著低于相应4周组（p＜0.01，p＜0.01）（表-1）。

免疫组化显示KDR蛋白在ELV组大鼠睾丸中也有表达（图5，6）。结果分析显示，在ELV4周组大鼠左（图5）、右侧睾丸中KDR蛋白的表达与对照组（图4）比较均显著增加（p＜0.01，p＜0.01），左右两侧之间其表达量也有明显差异（p<0.05）；ELV8周组（图6）KDR蛋白的表达和4周相应组比较有明显改变，且其表达量8周组均比相应4周组下降（p<0.01，p<0.01），左右组间未见差异（p>0.05）；和对照组比较未见差异（p>0.05）（表-1）。

统计分析表明，ELV4周组双侧睾丸中VEGF、KDR蛋白表达均上调，而ELV8周时两蛋白表达水平又下降，充分说明随着精索静脉曲张进程的延长，VEGF及其受体2的表达发生显著变化。提示可能随着ELV时间的延长，曲张对睾丸间质细胞、支持细胞和生精细胞造成的结构和功能的损害，使得VEGF与KDR蛋白合成与分泌的下降。说明ELV对睾丸的损害有累进性特点。

图　VEGF和KDR在对照组、ELV4周及8周组大鼠左侧睾丸上的免疫组化表达。标尺：50μ m。1,2,3:VEGF蛋白分别在对照组、ELV4周及8周组左侧睾丸中的表达情况。4,5,6: KDR分别在对照组、ELV4周组、ELV8周组大鼠左侧睾丸的阳性表达。Fig. Immunohistochemical expression of VEGF and KDR proteins in the left testis of the ELV rat, Scale: 50μ m.1,2,3: Expression of VEGF in the left testis of the control ,ELV4-and 8- week ELV groups,.4,5,6: KDR expression in the control,ELV4-week,ELV8-week groups testis.

表1　睾丸组织 VEGF、KDR免疫组化灰度值测定结果(Mean ±SD)Table 1. Immunohistochemistry image analysis results of VEGF and KDR proteins in the ELV testis (Mean ±SD)

3　讨论

多年来，精索静脉曲张（VC）被认为是导致育龄期男性不育的重要原因之一，发病大多在左侧，其对生育力的影响越来越受到许多学者的重视，但其发病机理尚未完全阐明。近年来发现VC 不育患者存在细胞分子及遗传学方面的异常，包括氧化应激[4]、基因多态性及细胞凋亡等[5]。还有学者认为青少年VC所致睾丸损伤与成人相似；并且对睾丸组织学损害具有累进性特点，与不育有相关性［6］。睾丸生精功能受神经－内分泌调节，多种生长因子［7］以及性激素在生精细胞的分裂、增殖、分化等过程中起重要作用［8］。在已发现的3种VEGF受体中，受体2即KDR是血管发生和构建的主要调节者，KDR与配体VEGF结合后介导内皮细胞的增殖、分化等行为。VEGF 刺激内皮细胞增殖、增加血管通透性和新血管生成的作用主要通过结合和激活KDR 来实现。有研究表明［9］，受体1和2与VEGF的亲和力不一样，Flt-1与VEGF 的亲和力比KDR与VEGF的亲和力高，但酪氨酸酶活性却比KDR低，所以Flt-1调节内皮细胞的活性比KDR低，Flt-1对血管的生成可能具有负向调节作用。

本研究采用免疫组化法发现VEGF和KDR蛋白在正常及ELV大鼠的睾丸组织中都有表达。对于ELV4周时两蛋白上调，我们可以这样解释：首先，由于VC使睾丸组织内呈现相对缺氧状态，并使CO2、乳酸蓄积和PH 值改变，影响睾丸发挥正常功能。 因为VC时，大鼠睾丸处于低氧环境，促进了低氧诱导因子-1 （hypoxia inducible factor-1α ， H IF-1α）的表达，而H IF-1α可激活目的基因的转录，VEGF即是其中的靶基因之一，可以导致VEGF-mRNA 持续和快速地增加，周可文等［10］也有研究发现VEGF 表达水平与HIF-1α呈同步性，说明VEGF在睾丸中可改善局部缺血缺氧环境，降低低氧对睾丸生精功能的负面影响。又由于VEGF可正向调节其受体1和2的表达，发挥生物学功能。因此，缺氧可能是两种蛋白上调的原因之一。其次，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）也是H IF-1α的靶基因，在睾丸组织缺氧状态下其活性增加，由于表达上调iNOS 的同时又促进了NO 合成增加，使得VEGF表达上调，改善VC 睾丸局部缺血缺氧状态，但当局部NO 的浓度超过生理量时，则造成生精功能损伤［11］。其次，ELV4周时，我们发现睾丸细胞损伤较轻，在腺垂体分泌卵泡刺激素（FSH） 和黄体生成素（LH）的作用下，睾丸间质细胞分泌睾酮作用增加，使血液中的睾酮升高［12，14］。众所周知，睾酮（T）对男性生育能力起到关键的作用。另外，国外学者在03年发现，睾酮可正向调节VEGF的表达［13］，所以在ELV4周时睾酮水平增加的情况下，VEGF表达水平随之上升。反过来说，VEGF与KDR结合后以自分泌和（或）旁分泌方式，作用于睾丸间质细胞调节睾酮的合成以调节正常的生精过程。所以在ELV初期，VEGF表达水平的上升也促进了KDR表达水平的上升，两者结合后诱导新生血管的形成，改善了精子发生的微环境，对ELV的睾丸功能起到积极的促进作用。

大量临床和实验资料证明，曲张组大鼠睾丸表现为睾丸萎缩，生精小管增厚［6］，超微结构显示间质细胞凋亡、变性，胞质内有大量溶酶体颗粒；支持细胞间紧密连接普遍断裂，胞质内线粒体及滑面内质网显著减少，胞质内出现大量溶酶体颗粒；精子细胞核畸形，核内有大量空泡、核膜、顶体消失，染色质浓缩成块状［14］。此外，国外学者Younes等研究证明，雄激素水平与ELV 的时程呈负相关［15］，随着ELV时间的延长对睾丸性激素分泌的影响也可能是睾丸内VEGF与KDR蛋白表达下调的因素之一。VC影响了睾丸性激素水平和精子发生的微环境，可能是引起不育的一个原因，虽然关于VC 的研究层出不穷，目前也已经达到分子水平，但VC 致不育的确切机制仍不十分明了，而VEGF和KDR的表达变化提示在雄性生殖方面起着一定的积极作用。

4　结论

综上所述，随着ELV进程的增长，VEGF和KDR的表达发生先增加后减小的变化，它们表达水平的变化可能影响睾丸内微环境的该变，从而间接改变精子发生、发育的过程，进而导致男性生育力的下降而导致不育，但是它们影响睾丸功能的具体机理、在精子发生和成熟中的具体作用、以及分子信号传导机制还需进一步探索和研究。

参考文献

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E-mail: mlx010305@163.com

中图分类号：R394.1；R318.16

文献标识码：A

DOI：10.11967/2016140309

基金项目：⋆延安大学校级科研项目（YDQ2014-49）资助

作者简介：马莉（1983-），女，陕西靖边县人，硕士，讲师。

Expression and Signifi cance of VEGF and KDR Proteins in the Testis of the ELV Rats

Li Ma， QingyanAi
（ Medical School of Yan'an University， Yan'an， Shanxi 716000， China ）

Abstract:Objective To study the expression changes of VEGF and KDR in the testis of experimental left varicocele 4-week and 8-week groups rats, Investigate the relative function of them and the pathological and physiological mechanism of male infertility caused by VC. Methods The testis were collected at 4 and8-week afterELV models of SD rats were established. Expression changes of the VEGF and KDR were detected by means of immunohistochemistry in the testis. Results Immunohistochemistry results showed The VEGF and KDR protein expression were up-regulated in 4-week groups compared with that of corresponding control groups , Expression ofVEGF and KDR protein were significantly decreased in 8 week groups compared with the control groups and 4-week groups. Conclusion The ELV procession affect the expression of VEGF and KDR protein in testis, which indicates that they may play an important role in male infertility caused by varicocele.

Key Words:VEGF; KDR; Experimental left varicocele ( ELV );Testis; Immunohistochemistry