圈养虎源大肠杆菌耐药性和整合子特性分析

薛　原，禹霭灵，张彦龙，何　莹，吕九云，王丽萍，柴龙会，孙　颖，黄显光，华育平

（1.东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.东北虎林园，黑龙江 哈尔滨 150040）

圈养虎源大肠杆菌耐药性和整合子特性分析

薛原1，禹霭灵1，张彦龙1，何莹1，吕九云1，王丽萍1，柴龙会1，孙颖1，黄显光2，华育平1

（1.东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.东北虎林园，黑龙江 哈尔滨 150040）

对东北虎林园分离的具有耐药性的大肠杆菌进行了整合子-基因盒的研究，结果表明：61株分离菌中整合酶Ⅰ检出率为52.46%，整合酶Ⅱ和整合酶Ⅲ均没检出。分离株对阿莫西林/克拉维酸、氨曲南和安普霉素较敏感；对氨苄青霉素、四环素和复方新诺明高度耐药。序列分析表明，含有3种基因盒，分别是dfrA15、dfrA12和aadA2。

东北虎；耐药性；大肠杆菌；整合子—基因盒

抗菌疗法用于治疗临床感染效果十分显著，但是耐药菌的出现对于人类、动物和环境是一个全球性的公共卫生问题。临床分离株耐药性增加的原因可能是由于抗生素的选择压力和整合子中的广泛存在。整合子是在细菌中发现的一种可移动基因元件，通过位点特异性重组捕获并表达外源性基因盒。这是导致耐药基因在细菌间水平传播的重要原因。因此，本项研究对圈养虎源耐药性大肠杆菌菌株进行了筛选和分析。

1　材料

1.1菌株质控菌：大肠杆菌ATCC25922，购自中国兽医药品监察所；临床菌株：2012-2013年从东北虎林园分离的61份大肠杆菌。

1.2药品阿莫西林/克拉维酸（AMC）、氨苄西林（AMP）、安普霉素（APR）、头孢噻吩（CEF）、环丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OF）、诺氟沙星（NOR）、恩诺沙星（EN）、氨曲南（ATM）、庆大霉素（GEN）、卡那霉素（KAN）、氯霉素（CMP）、多西环素（DOX）、复方新诺明（SXT）、氟苯尼考（FFC）、多黏菌素B（PB）、四环素（TET），购自杭州天和微生物试剂有限公司。

2　方法

2.1细菌的分离、纯化及培养将从东北虎林园采集的新鲜粪样分别于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板上培养，革兰染色镜检，生化鉴定。

2.2药敏试验采用WHO推荐的Kirby-Bauer法[1]。依据CLSI有关标准，每次测定均以质控菌为对照，只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株结果才有效。

2.3整合酶基因检测采用25 μL PCR扩增体系：2.5 μL 10×Buffer，2 μL dNTP，上下游引物各1 μL。设计整合酶Ⅰ基因、Ⅱ基因、Ⅲ基因扩增引物。循环参数为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，53.9℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸5 min。

2.4整合子-基因盒插入区的检测设计整合子基因盒插入区扩增引物。

2.5DNA序列分析扩增产物经胶回收纯化后，连接到pMD-18T载体，转化至E.coli DH5α，测序结果经Blast检索GenBank数据库，获得同源信息，分析其可能的功能。

3　结果

3.1药敏试验结果61株虎源大肠杆菌对17种抗菌药物均有不同程度的耐药性，药敏结果见图1。菌株对阿莫西林/克拉维酸、氨曲南和安普霉素有较高的敏感率，分别是73.66%、71.46%、71.71%。菌株对氨苄青霉素、四环素和复方新诺明有较强的耐药性，分别是100.00%、85.12%、80.24%。见图1。

图1　61株大肠杆菌对17种抗菌药物的体外药敏试验结果

3.2整合酶基因和基因盒检测结果I型整合酶基因PCR产物片段大小与预期相符，经测序和序列同源性分析，与GenBank中I型整合酶基因同源性为99%。61株大肠杆菌中32株I型整合酶基因扩增为阳性，检出率为52.46%，Ⅱ型整合酶和Ⅲ型整合酶均未检出，见图2。存在2种明显的基因盒特征dfrA15和dfrA12-aadA2。见图3、表1。

图2　部分I型整合酶基因PCR产物的电泳图谱

图3　PCR扩增基因盒插入区电泳结果

表1　大肠杆菌的耐药模式与整合子-基因盒的关系

4　讨论

国内外对于圈养野生动物和野生动物的耐药性研究报道较少。针对圈养野生动物和野生动物的耐药性研究，具有重要的生态学意义。同时对于野生动物细菌感染性疾病的防治和物种的保护具有积极的意义。从本研究可以看出，东北虎林园的受试虎源大肠杆菌对试验所采用的17种抗生素均有不同程度耐药性。分离的菌株中对氨苄西林的耐药比例高达到100%。同时也看出，受试大肠杆菌对阿莫西林/克拉维酸、氨曲南和安普霉素敏感性相对较高，敏感比例达到70%以上。虎源耐药性的产生原因可能是圈养虎日常食用家畜家禽，耐药质粒通过食物链进行传播。另外一个主要的原因是圈养虎的疾病防治过程中抗菌药物的使用。因此，应定期对菌株进行抗生素敏感性的监测。以临床用药或在饲料中添加药物时，尽量不要长期大量使用同几种药物，以免影响临床治疗效果及细菌耐药性的产生和扩散。

整合子可捕获和整合细菌的耐药基因，在细菌耐药性的传播和扩散中起到了至关重要的作用[3]。本研究采用PCR技术扩增特异性的整合酶基因，调查Ⅰ型整合子的存在及流行情况。结果表明，虎源大肠杆菌Ⅰ型整合子流行普遍，61株大肠杆菌中32株检出Ⅰ型整合子，检出率达52.46%。虎源大肠杆菌Ⅰ型整合子携带有aadA、dfrA等。整合子中最常见的基因盒为dfrA15（甲氧苄啶耐药基因）、aadA2（链霉素、大观霉素耐药基因），最主要的基因盒排列为dfrA15。与朱小玲等[4]报道的多重抗药大肠杆菌Ⅰ型整合子的平均检出率高，大多数整合aadA基因和dfrA基因相似。这表明Ⅰ型整合子广泛分布于大肠杆菌中。为了减少整合子介导和传播细菌耐药性，必须合理使用抗生素，减少抗生素的选择性压力。

[1]Khan A，Dass C，Ramamurthy T，et al.Antibiotic resistance，viru⁃lence gene，and molecular profiles of Shiga toxin producing Esch⁃erichia coli isolates from diverse sources in calcutta[J].India.J Clin Microbiol，2002，40（6）：2009-2015.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；16th information⁃al supplement.Document M100-S16.CLSI[J].Wayne，PA.2009：1-123.

[3]Gu B，Pan S，Wang T，et al.Novel cassette arrays of integrons in clinical strains of Enterobacteriaceae in China[J].Int J A ntimi⁃crob A gents，2008，32（6）：529-533.

[4]朱小玲，沈建忠，刘玉庆.多重抗药大肠杆菌中Ⅰ型整合子的分布与抗药关系[J].中国人兽共患病学报，2009，25（2）：135-138.

Characterization of integron-mediated antimicrobial resistanceamong Escherichia colistrains isolated from A CaptivePopulation OF Amur tiger

XUE Yuan1，YU Ai-ling1，ZHANG Yan-long1，HE Ying1，LV Jiu-yun1，WANG Li-ping1，CHAI Long-hui1，SUN Ying1，HUANG Xian-guang2，HUA Yu-ping1
（1.College of Wildlife Resources of Northeast Forest University，Harbin 150040，China；2.The siberian Tiger park，Harbin 150040，China）

The present study was performed to identify and characterize integrons and integrated resistance gene cassettes among multidrug resistant Escherichia coli isolates from a captive population of Amur tigers in China.Among the isolates，52.46% （32 of 61）were positive for intI1，but no isolates carried intI2 or intI3.Most isolates were susceptible to amoxicillin/clavulanic ac⁃id，aztreonam and polymyxin B，while they also exhibited high incidence rates of resistance to ampicillin，doxycycline，chloram⁃phenicol，tetracycline and trimethoprim sulfur.Sequencing analysis revealed three gene cassettes，which encoded resistance to dihy⁃drofolate reductase（dfrA15），dihydrofolate reductase（dfrA12）and adenyltransferase（aadA2）.

Amur tiger；antimicrobial resistance；Escherichia coli；gene cassette

HUA Yu-ping

S858.9

A

0529-6005（2016）07-0087-02

2015-04-16

国家自然科学基金（31502119）；黑龙江省教育厅科学技术研究（指导）项目（12543010）

薛原（1978-），女，讲师，博士，主要从事动物药理学与毒理学方面的研究，E-mail：xueyuan-1978@163.com

华育平，E-mail：huayuping@yeah.net