披针叶黄华内生真菌抑菌和α-葡萄糖苷酶抑制活性的筛选

杨林* ，周小凯，杨明俊，王永刚，石红霞（兰州理工大学 生命科学与工程学院，兰州 甘肃 730050）



披针叶黄华内生真菌抑菌和α-葡萄糖苷酶抑制活性的筛选

杨林* ，周小凯，杨明俊，王永刚，石红霞
（兰州理工大学 生命科学与工程学院，兰州 甘肃 730050）

目的∶从披针叶黄华内生真菌中筛选出抑菌和α-葡萄糖苷酶抑制活性较好的菌株。方法：采用植物组织块法分离披针叶黄华内生真菌，滤纸片法、分光光度法分别测定抑菌活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性大小。结果：从披针叶黄华的根茎叶中共获得16株内生真菌，其中，Tl-R-9的抑菌活性最好。10mg·mL-1时，3种测试细菌的抑菌圈都在15mm以上。Tl-R-6的α-葡萄糖苷酶抑制活性最高，达到94.7%。结论：披针叶黄华内生真菌在药用价值方面有较大的前景。

披针叶黄华；内生真菌；抑菌活性；α-葡萄糖苷酶抑制活性

披针叶黄华（Thermopsis lanceolata R. Br.）系豆科野决明属，主要分布在中国西北部地区，该植物全草可祛痰［1］。内生真菌是一类寄居在宿主植物体内而不引起植物任何明显疾病症状的微生物［2］。它常能产生一些有生物活性的次级代谢产物，其中的一些代谢产物在帮助宿主植物抵御外部不利因素方面起了很重要的作用［3］。最近10年，抗生素的滥用导致产生了很多的耐药细菌。因此加快寻找抑菌活性好的化合物就变得迫在眉睫。

α-葡萄糖苷酶抑制剂能竞争性抑制小肠内的α-葡萄糖苷酶的活性，从而延缓或抑制葡萄糖在肠道的吸收，最后有效地降低进餐后的高血糖［4］。目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂已被第三次亚太地区糖尿病治疗药物指南推荐为降餐后血糖的一线药物［5］。

1 、材料

1.1植物材料 披针叶黄华新鲜植株采集自甘肃省甘南藏族自治州。

2 、方法

2.1内生真菌的分离

新鲜的披针叶黄华植株在自来水下冲洗干净后，转移到75%乙醇中浸泡2min，无菌水冲洗3次，再转移到0.1%的升汞溶液中浸泡30s，无菌水冲洗3次。最后一次冲洗的无菌水取少量涂布在PDA培养基上。用无菌手术刀将植株的根、茎、叶分别切成0.5cm、0.5cm、1cm2的小块，然后转接到PDA培养基中28±1℃下培养，每个培养基中放4块，当有菌丝从组织块的切口处长出时，将菌丝挑取转移到新的PDA培养基中进行纯化培养，直到菌落单一。

2.2萃取物的制备

纯化的菌株接种到200mL PDB培养基中，28±1℃下摇床震荡培养10d，WhatmanNo1滤纸片过滤发酵液，然后用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液，旋转蒸发器旋干乙酸乙酯后得到粗萃取物。

2.3抑菌活性

选取地衣芽孢杆菌、绿脓杆菌和大肠杆菌作为测试菌，滤纸片法测定萃取物的抑菌活性。三种测试菌接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中37±1℃下摇瓶8h，然后用无菌蒸馏水将其稀释1000倍，吸取200μL测试菌液到牛肉膏蛋白胨培养基中，无菌涂布棒均匀涂布，取直径6mm的无菌滤纸片放于涂布好的平板上，每皿3片，然后吸取萃取物样液（DMSO溶解，10mg·mL-1）15μL滴在滤纸片上，DMSO溶剂为阴性对照，100U·mL-1的硫酸链霉素与青霉素钠为阳性对照，每个样品3个平行。

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性

萃取物用磷酸盐缓冲液（PBS，100mmol·L-1，pH6.9）配制成1mg·mL-1的样液。取0.5ml样液加到0.5mL 5mmol·L-1的p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）PBS溶液中（pH 6.9），混匀后在37℃下静置5min，然后1mL的α-葡萄糖苷酶（0.1U·mL-1）PBS溶液（pH6.9）加到试管中。37℃下反应10min后加入0.1mL 100mmol·L-1的Na2CO3来终止反应。405nm下测定吸光度值。抑制活性公式：抑制率（%）=（Ai-At）/Ai×100；Ai：不含样液的吸光度值；At：含有样液的吸光度值。

3、结果与讨论

3.1内生真菌的分离

通过组织块分离法，从披针叶黄华植物的根（9）、茎（5）、叶（2）中共分离得到16株内生真菌。

3.2抑菌活性

16株内生真菌的萃取物对3种测试菌的抑制活性中，只有内生真菌Tl-R-9抑制活性最好，三种测试菌的抑菌圈都在15mm以上，分别为地衣芽孢杆菌18mm、绿脓杆菌18mm、大肠杆菌16mm（图1）。其余内生真菌萃取物的抑菌圈都在10mm以下。阴性对照DMSO抑菌圈为0mm，阳性对照组青霉素钠对革兰氏阳性菌地衣芽孢杆菌的抑菌圈为42mm，硫酸链霉素对革兰氏阴性菌绿脓杆菌、大肠杆菌的抑菌圈分别为26mm 和28mm。内生真菌Tl-R-9最小抑菌浓度分别为地衣芽孢杆菌0.5mg·mL-1、绿脓杆菌1mg·mL-1、大肠杆菌1mg·mL-1。经过形态学分析，内生真菌Tl-R-9被鉴定为链格孢属。

图1　内生真菌萃取物对三种测试菌的抑菌圈；9为内生真菌Tl-R-9

3.3α-葡萄糖苷酶抑制活性 披针叶黄华内生真菌萃取物表现出较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。其中，1mg·mL-1浓度下，内生真菌Tl-R-4和Tl-R-6的抑制活性都在80%以上，Tl-R-6的活性最高，达到94.7%（图2）。经过形态学鉴定，内生真菌Tl-R-4和Tl-R-6分别属于链格孢属和毛霉属。

图2　内生真菌Tl-R-4和Tl-R-6不同浓度下的α-葡萄糖苷酶抑制活性

［1］陈冀胜，郑硕.中国有毒植物［M］.北京：科学出版社，1987：340-341.

［2］Arnold AE. Understanding the diversity of foliar endophytic fungi： progress， challenges， and frontiers［J］. Fungal Biol Rev， 2007， 21（2）：51-66.

［3］Azevedo JL， Macchroni W， Pereira JO， et al. Endophytic microorganisms： a review on insect control and recent advances on tropical plants［J］. Biotechnology， 2000， 3：40·65.

［4］许有瑞，倪京满，孟庆刚，等. 甘草中α-葡萄糖苷酶抑制剂的初步研究［J］.中药材，2005，28（10）：890-891.

［5］Floris A， Peter L， Reinier P， et al. α-Glucosidase inhibitors for pients with type 2 diabetes［J］.Diabetes Care， 2005，28（1）：154-163.

甘肃省自然科学基金（1310RJZA078）