基于16S rRNA基因文库技术分析水性涂料菌群的多样性

黄小茉,　陶宏兵,　邱晓颖,　李良秋,　施庆珊

1.广东省微生物研究所, 华南应用微生物国家重点实验室; 广东省菌种保藏与应用重点实验室, 广州 510070;2.广东迪美生物技术有限公司, 广州 510663



基于16S rRNA基因文库技术分析水性涂料菌群的多样性

黄小茉1,2,陶宏兵1,邱晓颖2,李良秋1,施庆珊1

1.广东省微生物研究所, 华南应用微生物国家重点实验室; 广东省菌种保藏与应用重点实验室, 广州 510070;2.广东迪美生物技术有限公司, 广州 510663

采用未培养技术直接提取变质涂料微生物总DNA，使用通用引物进行PCR扩增、纯化、连接、克隆和测序，建立16S rRNA基因文库，分析变质水性涂料细菌的数量与种类。从96个克隆子中共检测到8种不同种属的细菌，假单胞菌属(Pseudomonas)为优势菌群，占总数的75%，软骨酸芽孢杆菌(Paenibacilluschondroitinus)占总数的15%，此外豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)和粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)分别占总数2%。结果表明16S rRNA基因文库是一种较好的研究水性涂料细菌群落多样性的方法。

水性涂料；16S rRNA；细菌；多样性

水性涂料是以水为分散介质制得的涂料，由于其来源方便、成本低、无毒无刺激等特点，被广泛应用于内墙外墙、船舶、汽车等各个行业[1～3]。但由于采用的是水这一容易滋生细菌的溶剂，同时包含了大量纤维素和高分子材料，水性涂料相比其他涂料更容易引起微生物污染。变质的产品会出现变色、发臭、黏度下降等现象，不仅损害产品品牌形象，还会给生产厂商造成巨大经济损失。为保护产品的贮存和使用，目前大部分厂家采取的办法是在产品中添加防腐剂。但由于不同厂家的原材料来源和生产环境不同，污染的微生物种类有很大差别，为有针对性的建立微生物防控体系，需对导致产品变质的微生物有清晰全面的认识。

传统微生物纯培养方法研究对象主要为单个种质资源，虽然可以获得菌株，但可能遗漏潜在的重要有害微生物；采用16S rRNA基因文库方法既可以分析样品中细菌的种类，又可以反映各种细菌的相对比例，最重要的是通过这种方式可以检测到实验室条件下不能培养的细菌[4]。为探明变质水性涂料中细菌的多样性和群落结构组成情况，本实验采用16S rRNA基因文库技术分析变质水性涂料的群落结构组成情况，以期为针对性地建立水性涂料有效防腐体系提供充足的微生物数据。

1　材料与方法

1.1样品来源

某涂料公司提供的一桶发红、有异常气味的丙烯酸乳胶漆，且桶底有结块现象。

1.2主要试剂和仪器

试剂：苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)购自广州齐云生物工程有限公司；TE缓冲液(pH 8.0)、聚合酶链反应(PCR)试剂盒、DNA纯化试剂盒、DNA Marker购自天根生化试剂公司；凝胶回收试剂盒、纯化和T载体连接试剂盒、感受态细胞购自TaKaRa公司。

主要仪器：台式冷冻离心机(Biofuge primo R)；PCR扩增仪(Eppendorf Mastercycler 5333)；电泳仪(GE Healthcare Ettan DALT six)；凝胶成像系统(Alpha)。

1.3实验方法

1.3.1样品总DNA提取及纯化采用直接法提取涂料中微生物的DNA，首先将样品进行预处理[5]，将预处理的样品液氮冻融处理3次后，用TE缓冲液冲洗至50 mL的离心管中，然后用溶菌酶-SDS-酚/氯仿法提取总DNA[6]，最后用DNA纯化试剂盒将粗提DNA进行纯化。

1.3.2PCR扩增和克隆文库构建以提取的DNA为模板，采用细菌通用引物F27： 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；R1492：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′进行16S rRNA基因的PCR扩增。扩增程序：95℃预变性3 min；94℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸1.5 min，30个循环；72℃延伸10 min。采用凝胶回收试剂盒对扩增产物进行切胶纯化。用载体pMD19-T进行16S rRNA基因的连接后，转化至E.coliDH5a感受态细胞，每份标本平行做2次。以氨苄西林(60 μg/mL)抗性和蓝白斑筛选阳性克隆子，采用T载体通用引物对阳性产物进行PCR验证，将PCR检测为阳性的克隆送到英骏生物技术公司进行测序。

1.3.3序列比对分析测序结果用DECIPHER软件去除嵌合体，用Ribosomal Database Project (RDP) Release 1中的分类程序对所有序列进行分类分析。用Mothur软件划分分类操作单元(OTU)，将相似性>97%的序列视为同一个OTU，计算文库的覆盖率(C)，克隆文库的覆盖率公式为:

C=1-n1/N

其中n1代表文库中只有一个克隆的OTU个数，N代表文库总的OUT个数。

选取每个OTU代表序列，分别与Eztaxon数据库中已发表的菌株16S rRNA基因进行相似度比对，将统计结果按序列的相似程度百分比进行分类统计分析，利用MEGA 3.1中Kimura 2参数矩阵临接法构建系统发育分析。

2　结果与分析

2.1涂料样品总DNA的PCR扩增及阳性克隆的验证

利用细菌通用引物进行涂料样品细菌16S rRNA扩增，结果得到1 500 bp大小的条带。可以看到所有样品总DNA的PCR产物均在1 500 bp左右，没有非特异性条带，说明本提取方法得到的总DNA纯度高，不含PCR反应抑制物。可满足后续的分子生物学技术应用的要求。用PCR法对阳性克隆进行验证，有1 500 bp特异性条带的样品为阳性克隆，反之则为假阳性。挑取阳性克隆构成细菌的16S rRNA基因文库。

图1　PCR法验证阳性克隆子Fig.1　Validation positive clones using PCR method.M：DNA Marker；1～15：阳性克隆；16：阴性对照

2.2涂料样品中细菌16S rRNA基因克隆文库系统发育分析

从涂料样品细菌16S rRNA基因克隆文库中随机挑选96个克隆子进行鉴定，用DECIPHER软件去掉6个嵌合体。剩余的90个序列经Mothur软件分析，共划分了8个OTU。文库覆盖率C值达到100%，说明所获得的序列可以较全面的反应样品的生物多样性。将文库中的序列上传到GenBank，得到登录号为KX242390-KX242397。变质涂料中的主要微生物为假单胞菌属(Pseudomonas)的菌株，占克隆子总数的75%，除假单胞菌外，还有14个克隆子为软骨酸芽孢杆菌属(Paenibacilluschondroitinus)，占克隆子总数的15%。 此外还各有2个克隆子比对获得的最大相似度菌株为豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)和粪产碱杆菌酚降解菌(Alcaligenesfaecalis),分别占总数的2%。

图2　基于16S rRNA基因克隆文库构建的系统发育树Fig.2　Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences.

通过系统发育分析，样品中所有菌种与已发现的菌种相似性>97%，变质样中的优势菌群为假单胞菌。假单胞菌是工业腐败微生物中一类常见的菌群,高分子化合物、芳香族化合物、卤代衍生物和有机体残渣都可成为其有用的底物，具有广谱的底物利用性[7,8]。而且其不仅在4～7℃的低温条件下可以生长，还能产生耐热的蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶，在高温下依然具有活性[9,10]。因此在日化产品、乳胶漆、胶黏剂等产品中常有检出[11,12]。

3　讨论

对常规手段难以分离培养的样品通过16S rRNA基因克隆文库技术分析是一种较全面的检测手段。在分析样品的菌群结构时，对样品中的各种细菌是无选择性检测，通过代表不同细菌种类的克隆子的数量计算各种细菌的相对数量，具有传统培养方法难以比拟的优势。但将该技术应用于水性涂料细菌群落多样性研究时也面临着一个问题，水性涂料组分和结构复杂，尤其是发生腐败后，杂质成分多，性状差异大，总DNA提取困难。研究表明，提取的总DNA质量是后续分子生物学实验研究的关键[13,14]。本研究采用预处理得到的DNA电泳条带较未处理明显整齐。原因是对样品进行预处理可以很好地去除杂质，减少胞外游离DNA和有机物污染。而且预处理的缓冲液中含有EDTA，可以有效络合金属离子，抑制核酸酶的活性，避免在提取过程中DNA被降解。因此，经预处理方法得到的DNA比不经处理得到的DNA要纯净，再通过纯化后能获得高质量的涂料微生物总DNA。

本研究的1例变质涂料中假单胞菌为优势菌，占到样本总菌落的75%，除假单胞菌外，还有软骨酸芽孢杆菌属、豚鼠气单胞菌和粪产碱杆菌酚降解菌，这与其他对引起涂料变质的微生物研究结果比较一致。陈艺彩等[15]对胶黏剂、白乳胶、涂料分离的76株腐败微生物分析发现，芽孢杆菌、假单胞菌和肠杆菌是最主要的菌属；英国阿拉丁国家工业和海洋细菌收集中心(National Collections of Industrial, Food and Marine Bacterial, NCIMB)的数据显示，引起乳液和涂料腐败的主要菌属为铜绿假单胞菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。

通过对变质水性涂料的细菌克隆文库进行研究，发现细菌多样性相对较少。出现这种现象的原因可能是产品长期固定使用单一种类防腐剂，限制了某些细菌的生长，同时促进了其他类型的细菌生长，从而产生优势菌。但具体是因为该变质样防腐体系失效，还是微生物产生了耐药性导致产品腐败变质还需进一步验证，同时本研究只对细菌的16S rRNA基因进行克隆构建，对变质涂料中的真菌类型还不能全面认识，需要进一步研究。

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Analysis of Waterborne Coating Bacterial Diversity by the 16S rRNA Gene Library

HUANG Xiao-mo1,2, TAO Hong-bing1, QIU Xiao-ying2, LI Liang-qiu1, SHI Qing-shan1

1.StateKeyLaboratoryofAppliedMicrobiologySouthernChina;GuangdongProvincialKeyLaboratoryofMicrobialCultureCollectionandApplication,GuangdongInstituteofMicrobiology,Guangzhou510070,China;2.Guangdong Demay Biological Technology Co., Ltd, Guangzhou 510663, China

TotalmicrobialDNAwasdirectlyextractedfromametamorphicwaterbornecoating,theclonelibraryof16SribosomalRNAgeneswasamplifiedusingPCRwithuniversalbacterialprimersets.ThePCRproductswerethensubclonedintopGEM-Tvector,amplifiedDNAwasusedfordiversityanalysis.Thetotalof96cloneswereselectedand8kindsofmicrobewhichwereusedforsequencing. Pseudomonaswasthemostone(75%oftotalclones),thenwasPaenibacillus chondroitinus (15%oftotalclones), Aeromonas caviaeandAlcaligenes faecalisaccountedfor2%oftotalclonesrespectively. 16SrRNAgenelibraryisagoodresearchmethodforwaterbornebacteriacommunitydiversityanalysis.

waterbornecoating; 16SrRNA;bacterial;diversity

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.13

2016-04-29; 接受日期：2016-06-22

广东省科技计划项目(2013B090600148; 2013B050800023);揭阳市产学研结合项目(201429)资助。

黄小茉，高级工程师，研究方向为工业产品微生物危害防治。Tel：020-87137503;E-mail：molyhuang@21cn.com