河北核桃ISSR反应体系的建立

雷　玲，王红霞，高　仪，张志华*

（1河北省赞皇县林业旅游局　051230；2河北农业大学山区研究所；3河北农业大学园艺学院）



河北核桃ISSR反应体系的建立

雷玲1，王红霞2，高仪3，张志华2*

（1河北省赞皇县林业旅游局051230；2河北农业大学山区研究所；3河北农业大学园艺学院）

摘要：以3个河北核桃样品为材料，对ISSR反应体系中的主要影响因子DNA模板浓度、引物浓度、�DNA聚合酶用量、退火温度进行优化筛选。最后确定河北核桃 ISSR-PCR反应体系为 20L体系中含 10×PCR Buffer （Mg2+Plus）2L，dNTPs（各2.5 mM）1.6L，DNA聚合酶1.0 U，引物25M，模板DNA 50 ng。反应的基本程序为：94℃预变性5 min（1个循环），然后94℃变性30 s，52℃退火60 s，72℃链延伸60 s（32个循环），72℃延伸10 min（1个循环），4℃保持。不同引物间适宜的退火温度不同。通过对影响 ISSR反应体系的主要因子进行优化筛选，建立了适合河北核桃 ISSR分析的反应体系，为进一步开展河北核桃指纹图谱、遗传多样性及品种鉴定等的研究奠定基础。

关键词：河北核桃；ISSR；反应体系

河北核桃（Juglans hopeiensis Hu）又称麻核桃［1］，自然群体中类型较多，坚果的大小、形状、纹理的起伏及变化等存在较大差异，并且其引种资源也比较混乱，国内通过鉴定的河北核桃新品种唯见张志华等［2］选育的“艺核1号”，因此，建立河北核桃ISSR反应体系为品种鉴定和育种改良打下基础是非常必要的。ISSR （inter-simple sequence repeat）是由Zietkiewicz等于1994年创建的一种新型的分子标记［3-5］，这种SSR指纹是用SSR为引物来扩增重复序列之间的区域，因此又称为Inter-SSR，简称ISSR［3］。

因ISSR分子标记技术特点其应用越来越广泛，柑橘、苹果和枇杷等物种的反应体系及其品种的指纹图谱相继建立［6-10］。在核桃属ISSR体系建立方面也有些报道，如陈少瑜等［11］以漾濞核桃为研究对象，建立了适合漾濞核桃ISSR-PCR分析的反应体系。河北核桃坚果个大、种皮厚且表面纹理皱褶变化多样，适宜雕刻、观赏和玩耍等，民间称之为“耍核桃”或“文玩核桃”。随着人民生活水平提高，将麻核桃作为健身品的兴趣随之日益浓厚，其越来越受人们的重视。建立和优化河北核桃ISSR反应体系，为进一步开展河北核桃指纹图谱、遗传多样性、品种鉴定及育种改良等的研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料本试验随机选取大边公子帽5号、昌平麻核桃和杨伟公子帽三份材料。材料均采自定州小奇连德胜农林科技有限公司核桃园。取其幼嫩叶片，低温下带回实验室，液氮速冻，放入超低温冰箱中保存待用。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取方法采用加3%PVP40的高盐低pH法进行基因组DNA提取，具体方法参照文献［］。

1.2.2ISSR反应体系的初始条件ISSR-PCR反应体系参照TaKaRa Taq（宝生物工程有限公司）产品说明初步确定如下。

反应的基本程序为：94℃预变性5 min（1个循环），然后94℃变性30 s，52℃退火60 s，72℃链延伸60 s（32个循环），72℃延伸10 min（1个循环），然后4℃保持。

1.2.3ISSR反应体系的优化本试验采用单因素递进的筛选方法，对DNA模板浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶用量、退火温度等作了比较分析。引物参照杨恩［13］确定的ISSR引物序列，由上海生工生物工程有限公司合成，应用筛选的随机引物ISSR01、ISSR08优化反应体系。

TaqDNA聚合酶的用量设为6个水平：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 U；引物浓度设为5个水平：10、20、 25、30、40M；DNA浓度设6个水平：10、30、50、70、 90、100 ng。

ISSR-PCR反应基本体系确定后，根据每个引物自身的Tm值做退火温度梯度试验。具体方法如下：在该引物的Tm值左右各加或减5℃确定大概范围，使用的PCR仪（Bio-Rad）能自动将这个温度范围由高到低分为8个不同的温度。然后，将所得结果进行2%琼脂糖凝胶电泳，最后根据电泳图像确定该引物的最佳退火温度。

2　结果与分析

2.1TaqDNA聚合酶用量在PCR反应中，TaqDNA聚合酶用量受到反应体积、酶活性等方面的影响。酶量过多会使扩增产物的非特异性增加，且形成浪费，提高成本；过少则产量降低甚至扩增失败。TaqDNA聚合酶用量设0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 U 6个水平，其中聚合酶用量为0.5、1.5、2.0、2.5、3.0 U时检测到其扩增条带弥散且不清楚，结果以1.0 U扩增的谱带清晰效果最好（图1）。

图1　TaqDNA聚合酶用量的筛选注：M为DL2000；泳道1～6：DNA聚合酶用量分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 U。

2.2引物浓度引物浓度对扩增产物的产量与特异性、对PCR的带型产生都有影响，引物浓度的降低会使引物与模板的结合率降低，产生的多态性条带减少，特别是低分子量的条带。本试验引物浓度设10、20、25、30、40M 5个水平，结果以25M扩增的谱带多而清晰（图2）。

图2　引物浓度的筛选注：M为DL2000；泳道1～5：所选引物的浓度分别为10、20、25、30、40　M。

2.3模板DNA浓度在一定范围内模板DNA含量对ISSR扩增结果的影响不大［14］，本研究对模板DNA的浓度设10、30、50、70、90、100 ng 6个水平，结果以50 ng DNA含量扩增的谱带效果最好，其他扩增的条带少且不清晰（图3）。

图3　DNA模板浓度的筛选注：M为DL2000；泳道1～6：模板DNA浓度分别为：10、30、50、70、90、100 ng。

经过上述各因子的筛选，最后确定河北核桃的ISSR-PCR反应体系为：20L体系中含10×PCRBuffer（Mg2+Plus）2L，dNTPs（各2.5 mM）1.6L，TaqDNA聚合酶1.0 U，引物25M，模板DNA 50 ng。

2.4引物退火温度引物的退火温度对ISSR-PCR的影响非常明显，不同的引物其退火温度亦不相同，为了得到专一性好、分辨率高的扩增谱带，本试验对引物进行退火温度的测定。图4是对引物ISSR08进行的退火温度筛选，结果以53.2℃扩增的条带最清晰（图4）。

图4　不同退火温度对扩增结果的影响注：M为DL2000；泳道1～8：56、55.4、54.6、53.2、51.5、50.3、49.4、49℃。

2.5优化条件的应用按照以上扩增体系，利用引物ISSR08对18个河北核桃样品进行PCR扩增，结果表明，这18个河北核桃样品均能扩增出清晰可辨的条带，多态性较高，条带分子量一般都在2 000 bp以内（图5）。说明本试验优化的体系适合河北核桃ISSRPCR扩增。

图5　部分样品材料的ISSR扩增结果电泳图（引物ISSR08）注：从左向右样品依次为：细纹狮子头、宝鸡大边公子帽、宝鸡鸡心、涞水2号、邯郸狮子头、宽边狮子头、YW、大边公子帽5号、昌平3号、WW、昌平17号、昌平4号、昌平8号、昌平6号、涞水6号、杨伟狮子头、涞水5号、昌平19号，DL2000 marker。

3　结论与讨论

ISSR技术虽然具有重复性好、原理简单的优点，但由于ISSR是基于PCR的一种标记技术，其稳定性易受许多因素的干扰。为此，必须对河北核桃ISSR反应体系进行优化。

PCR反应中对模板浓度要求的范围较宽，但不同材料及提取方法会对 DNA纯度产生影响，其最佳DNA用量也是不同的，所以对DNA浓度进行优化是必要的。

引物的浓度是影响扩增特异性的重要因素之一，较低或较高的引物浓度均不能得到清晰的产物。本试验中所设计的几个引物浓度中，结果以25M效果最佳。

Taq酶的用量也是影响PCR的一个重要因素，本试验选用1.0 U的Taq酶为最佳用量，与果树上已建立的柑橘类［15-16］、板栗［17］等ISSR反应体系的TaqDNA聚合酶用量相同。

引物的退火温度极大地影响着ISSR反应的进行，引物、物种或类型不同，其退火温度亦不相同。本试验与杨恩使用同一物种不同类型的材料，利用同一引物，其退火温度亦不相同。所以必须对引物退火温度进行筛选，确定最佳温度，提高反应的特异性。此外，为确保试验的稳定性，尽量选用同型号仪器、同一厂家同批药品与试剂等。

参考文献：

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［2］张志华，郗荣庭，高仪，等．河北核桃新品种‘艺核1号’［J］．园艺学报，2006，33（3）：689．

［3］Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D．Genome fingerprint ing by simple sequence repeat（SSR）anchored polymerase chain reaction amplification．Genomics，1994，20（2）：176～183．

［4］Gupta M，Chyi Y S，Romero-severson J．Amplification of DNA markers from evolrtionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats.Theoretical and Applied Genetics，1994，89（7/8）：998～1006．

［5］Huang J C，Sun M．Genetic diversity and relationships of sweetpotato and its wild relatives in Ipomoea series Batatas （Convolvlaceae）as revealed by ISSR and restriction analysis of chloroplast DNA．Theoretical and Applied Genetics，2000，100：1050～1060，

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［9］穆立蔷，刘赢男，冯富娟，等．紫椴ISSR-PCR反应体系的建立与优化［J］．林业科学，2006，6（2）：16～31．

［10］宣继萍，章镇，房经贵，等.苹果品种ISSR指纹图谱构建［J］.果树学报，2002，19（6）：421～423.

［11］陈少瑜，杨恩，范志远，等．漾濞核桃ISSR-PCR反应体系的建立［J］．西部林业科学，2007，4（36）：109～112.

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［13］杨恩．云南省主要推广核桃品种分子标记鉴别及遗传分析［D］．硕士毕业论文，西南林学院，2006.

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［15］吴鑫．柑桔DNA指纹图谱库的构建与分析［D］．硕士学位论文．重庆：西南大学，2008.

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国家科技支撑计划项目（2006BAD01A17）

中图分类号：S664.1

文献标识码：A

文章编号：1006-9402（2016）02-0005-03

收稿日期：2016-01-05

*通讯作者：张志华