皮卡佐剂狂犬病治疗性疫苗对暴露后实验动物和人体免疫记忆的效果

林海祥　徐葛林　吴杰　张守峰　扈荣良　李烈涛　刘芳　张师瑞　张译

102600, 北京依生兴业科技有限公司(林海祥、李烈涛、刘芳、张师瑞、张译)；430207,武汉生物制品研究所(徐葛林、吴杰)；长春 130117，中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所(张守峰、扈荣良)



皮卡佐剂狂犬病治疗性疫苗对暴露后实验动物和人体免疫记忆的效果

林海祥徐葛林吴杰张守峰扈荣良李烈涛刘芳张师瑞张译

102600, 北京依生兴业科技有限公司(林海祥、李烈涛、刘芳、张师瑞、张译)；430207,武汉生物制品研究所(徐葛林、吴杰)；长春 130117，中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所(张守峰、扈荣良)

【摘要】目的检测皮卡佐剂狂犬病疫苗对暴露后实验动物免疫治疗作用和对人的免疫记忆效果。方法模仿人体暴露后免疫，对小白鼠和Beagle犬进行了先感染狂犬病毒野毒株病毒再用不同狂犬病灭活疫苗免疫，观察保护效果；对犬咬伤志愿者用皮卡佐剂狂犬病疫苗免疫2.5年后分离外周血单个核细胞，用流式细胞仪检测干扰素免疫记忆细胞数量。结果在法国巴斯德研究所、武汉生物制品研究所、军事医学科学院军事兽医研究所三次独立实验结果均显示在没有联合应用抗狂犬病免疫球蛋白的情况下，国内外市售人用狂犬病疫苗保护率为0%～30%，皮卡佐剂狂犬病疫苗保护率为70%～100%，统计学分析有极其显著的差异。暴露后志愿者用皮卡佐剂狂犬病疫苗免疫，2.5年后外周血单个核细胞仍能检出显著高的分泌IFN-γ细胞数量，显示对人体免疫特别是细胞免疫记忆反应良好。结论与市售狂犬病疫苗相比，皮卡佐剂狂犬病疫苗对暴露后实验动物具有显著地 治疗作用，在人体中用也具有良好的免疫记忆效果。

【主题词】皮卡佐剂；狂犬病疫苗；免疫记忆；暴露后免疫

Fundprograms:MajorNewDrugDiscoveryProject(PICKCaRabiesVaccineforHumanUse: 2013ZⅩ09102034 )

皮卡佐剂是多种膜式识别受体(PRR)的配体，包括TLR3(Toll样受体3)、NOD(细胞内核苷酸结合寡核苷酸域)蛋白家族、RIG-Ⅰ(RNA螺旋酶视黄酸诱导基因Ⅰ)、MDA5(黑色瘤分化相关基因5)依赖dsRNA蛋白激酶等。皮卡佐剂疫苗与受体结合后活化非特异免疫，包括巨噬细胞吞噬功能，促进干扰素、白细胞介素-2、-6、-12、肿瘤坏死因子等细胞因子的产生，促进产生共刺激因子CD40、CD80、CD86，促进抗原呈递细胞的提呈，活化T淋巴细胞，促进特异性的细胞免疫和体液免疫应答，促进免疫细胞的增殖。皮卡佐剂不仅提高疫苗的免疫原性，更由于促进干扰素、白细胞介素-2、-12的产生，使从主要产生体液免疫的预防性疫苗转变成具有强烈细胞免疫的治疗性疫苗[1-7]。本文是在上述研究基础上模仿人体暴露后免疫对试验动物先外周皮下或肌肉感染狂犬病毒街毒，再用皮卡佐剂狂犬病疫苗免疫并与国内外市售狂犬病疫苗从机体水平比较保护率。除此之外，我们还对狗咬伤志愿者接种皮卡佐剂狂犬病疫苗，2.5年后的外周血单个核细胞，用流式细胞仪检测分泌IFN-γ的细胞数量。这些试验都取得了明确的显著的阳性结果。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：OF1小白鼠，4周龄。由法国巴斯德研究所提供。昆明种小白鼠：14～16g，清洁级，由武汉生物制品研究所实验动物中心提供。Beagle犬：40只，购自北京玛斯生物技术有限公司。由军事医学科学院军事兽医研究所按筛选无狂犬病免疫史，狂犬病中和抗体检测阴性犬，试验前完成犬瘟热和细小病毒疫苗免疫。

1.1.2外周血单个核细胞：2002年本公司员工白XX、屈XX被犬咬伤后，主动要求自愿用人用皮卡狂犬病纯化疫苗(中检所检验合格后的人用皮卡狂犬病纯化疫苗，由北京泛华协和医药生物技术股份有限公司生产)全程五针免疫，2.5年后取外周血分离单个核细胞；另有健康者(2人)外周血分离单个核细胞比较，由中山医科大学检测。

1.1.3狂犬病毒野毒株：WRVS9147(RD9147)株：法国巴斯德研究所提供。从疯狐狸中分离，经成神经瘤细胞传代，检测其核蛋白基因的核苷酸顺序与原分离时相同，表明WRVS株的性质并没有因在细胞中传代而改变。攻毒剂量为脑内5×106LD50/只小鼠。CQ92株(批号20050207)武汉生物制品研究所基因工程室提供。该毒株1992年分离于重庆犬，后经该室在小鼠脑中传代制备，作为攻击用毒株。通过基因序列分析，表明该毒株为我国狂犬病毒流行株，且属于血清Ⅰ型。本试验病毒脑内滴定为12589/0.03mlLD50，腹股沟皮下毒力为3.3/o.1mlLD50。BD06株：军事医学科学院军事兽医研究所提供。2006年分离自河北保定的犬源街毒，经全基因组序列测定为我国狂犬病流行株，为基因Ⅰ型。经小鼠脑内传代5代以内用于攻毒试验，攻毒剂量为脑内16万LD50(小鼠脑内)。

1.1.4用于小白鼠试验的狂犬病疫苗：灭活纯化狂犬病疫苗(InactivatedandPurifiedRabiesVirus：IPRV)，法国巴斯德研究所提供。用PV狂犬病毒株经BHK-21细胞传代，病毒收获后经β-丙内酯灭活和纯化后的实验用疫苗。皮卡IPRV：将皮卡佐剂与不同浓度的IPRV复合。市售法国维尔博狂犬病疫苗(批号X0081-1，生产日期20030123，有效期200512)。市售福尔博人用狂犬病纯化疫苗福尔博(简称国产苗)(批号2004110810，生产日期20041202，效期200512)。人用皮卡狂犬病纯化疫苗由北京泛华协和医药生物技术股份有限公司提供。

用于犬试验的人用皮卡狂犬病疫苗由辽宁依生生物制药有限公司提供；市售诺华人用狂犬病疫苗由军事医学学科学院军事兽医研究所直接联系长春市疾病预防控制中心购买。

用于人免疫记忆试验的狂犬病纯化疫苗抗原由大连高新生物制药有限公司提供；皮卡佐剂和皮卡狂犬病疫苗由北京泛华协和医药生物技术股份有限公司及辽宁依生生物制药有限公司提供。

1.2方法

1.2.1第一项试验：在法国巴斯德研究所完成(1992年)。取OF1小鼠，每组小鼠先用野毒WRVS9147腹股沟皮下感染小白鼠，0.1ml/只，攻毒剂量为脑内5×106LD50/只小鼠(确保80%以上小白鼠致死的攻击病毒量)，于感染后0d、3d、7d、10d和14d在相同部位分别注射不同抗原量(140ng和 560ng)的疫苗(狂犬病纯化疫苗、皮卡佐剂狂苗及铝佐剂狂苗)0.1ml/只，同时设PBS、皮卡佐剂、铝佐剂对照组。连续28d观察记录小鼠发病及死亡情况，并统计结果。

1.2.2第二项试验：在武汉生物制品研究所完成(2005年)。取清洁级昆明小鼠80只，分为4组，每组20只。用街毒株CQ92(批号20050207)腹股沟皮下感染小白鼠，本试验病毒脑内滴定为12589/0.03mlLD50，腹股沟皮下毒力为3.3/o.1mlLD50。感染后0d、3d、6d、9d，分别用皮卡狂苗、福尔博狂苗、维尔博狂苗同部位免疫0.06ml/只，病毒对照组注射PBS。连续21d观察记录小鼠发病及死亡情况，并用统计学方法统计实验结果。

1.2.3第三项试验：军事医学科学院军事兽医研究所(2013年)。狂犬病中和抗体阴性的Beagle犬30只，均分为三组，每组10只。试验前右侧腮部剃毛，以显露皮肤及咬肌轮廓。16万icLD50狂犬病病毒(1ml)注射于Beagle犬右侧腮部肌肉；攻毒后2h、3d、7d、14d、21d后于注射部位分别注射PBS、人用诺华狂犬病疫苗、皮卡狂犬病疫苗。

上述各组动物观察45d，3d内死亡为非特异性死亡，第4天以后逐天记录各组狗发病数、死亡数，发病和死亡时间，第45天记录各组狗总死亡数和存活数。试验前后测量狗的体重。对死亡和存活动物进行脑组织狂犬病免疫荧光检测，确定是否感染狂犬病毒。

1.2.4第四项试验：在北京泛华协和医药生物技术股份有限公司，志愿者用皮卡佐剂狂犬病疫苗免疫，取用皮卡狂犬病纯化疫苗免疫2.5年后志愿者和未经皮卡狂犬病疫苗健康者外周血分离单个核细胞(PBMCs)。分别用1.45和14.5μɡ狂犬病纯化疫苗抗原刺激24h，以流式细胞仪检测分泌IFN-γ的细胞数量.。

2结果

2.1第一项试验如表1所示，在病毒对照小白鼠95%死亡下，单纯IPRV保护率很差，死亡率达70%～95%；单纯皮卡佐剂就使死亡率降至30%，随着IPRV与皮卡复合的IPRV量的增加死亡率可降至0；IPRV加铝佐剂没有任何效果。

2.2第二项试验两次皮卡狂犬病疫苗和不同市售狂犬病疫苗对暴露后小白鼠的保护率的比较结果见表2。统计学测定表明皮卡狂犬病疫苗和不同市售狂犬病疫苗比较具有极其显著的治疗效果(P<0.01-0.001)。

2.3第三项试验在病毒对照组犬100%死亡情况下，皮卡狂犬病灭活疫苗产生70%保护作用，经统计学测定，与病毒对照组比较具有极其显著差异，而诺华制药的狂犬病疫苗仅提供30%的保护作用，与病毒对照组比较差异不显著(表3)。

表1　皮卡和铝佐剂对感染狂犬病毒野毒株WRVS 9147小白鼠的治疗效果

* 死亡小鼠数/注射小鼠数

Numbersdiedmice/Numbersinjectedmice

表2　不同疫苗对暴露狂犬病街毒后小白鼠的保护试验

x2皮卡苗与PBS对照=14.44P<0.001 x2皮卡苗与法国维尔博苗=16.9P<0.001 x2皮卡苗与国产狂犬病铝苗=10.23P<0.01

Note:Numbersdiedmice/Numbersinjectedmiceandthenumbersweremeansofmicein2experiments,PICKCavaccinevscontrolFrendvaccine,ChineseFurbovaccine

2.4第四项试验皮卡狂犬病疫苗免疫志愿者2.5年后用流式细胞仪检测分泌IFN-γ的细胞数量。与未注射狂犬病疫苗正常人比较经相应抗原刺激后分泌IFN-γ细胞数显著增加。表明皮卡狂犬病疫苗对人体也有很好的免疫反应(图1)。

3讨论

3.1关于NIH狂犬病疫苗效力测定方法当前通用的狂犬病疫苗效力测定方法是1953年由美国国立卫生研究所(NIH)建立的，该方法以不同稀释度疫苗0、7d腹腔免疫小白鼠两次，第14天用5～50脑内LD50CVS病毒脑内攻击，再观察14d，以死亡率与疫苗参考品比较，≥2.5IU/每剂为合格。该方法存在明显不合理处：(1)攻击病毒CVS是脑内固定毒，不是流行区的野毒或街毒。(2)脑内攻击途径非自然感染途径(3)更重要的是NIH狂犬病疫苗效力测定方法是暴露前免疫，而人是暴露后免疫，这是两种性质完全不同的免疫，这是预防性疫苗检测方法，不适合用于暴露后免疫。当前批签发检定合格的疫苗不是一定有效的疫苗[8]。

表3　皮卡苗和诺华狂犬病纯化疫苗对暴露狂犬病街毒后的比格犬保护效果

图1　皮卡佐剂狂犬病疫苗免疫志愿者2.5年查外周血单个核细胞产生IFN-γ SPF数量Fig.1　IFN-γSPF in PBMCs of volunteers immunized with rabies vaccine using PICKCa adjvant

3.2关于WHO和国家药典对暴露后狂犬病防治方案正是由于当前通用狂犬病疫苗效力测定方法不合理以及大量狂犬病疫苗免疫失败病例，WHO和国家药典[9]都明确规定对3度咬伤即被咬出血患者除清洗伤口外应联合应用抗狂犬病毒免疫球蛋白和疫苗，而不能仅注射疫苗。然而由于马抗狂犬病免疫球蛋白过敏反应严重，人抗狂犬病免疫球蛋白价格昂贵，供不应求，只有7%～10%的患者使用抗狂犬病免疫球蛋白[10]，至今使我国每年仍有上千狂犬病死亡病例！

3.3关于皮卡狂犬病疫苗的意义我们经过30年的研究积累了大量试验资料，明确了皮卡佐剂及其疫苗作用机理，皮卡狂犬病疫苗不仅促进体液免疫也能诱发强烈的细胞免疫而具有治疗作用。对小白鼠和狗先行皮下或肌肉感染狂犬病野毒株病毒，再用狂犬病疫苗免疫治疗结果是法国维尔博狂犬病疫苗和国产铝佐剂狂犬病纯化疫苗对暴露后小白鼠的保护率为0，人用皮卡狂犬病纯化疫苗的保护率为75%。表明皮卡狂犬病纯化疫苗能显著地降低感染狂犬病野毒株小白鼠死亡率，明显地优于法国维尔博狂犬病疫苗和国产铝佐剂狂犬病纯化疫苗(P<0.001)，特别应引起注意的是在人体检测中皮卡狂犬病纯化疫苗也有良好的免疫记忆反应，使分泌IFN-γ细胞数显著增多。同时，皮卡狂犬病疫苗也是安全的[11]，用于暴露后3度咬伤患者较现行国内外无佐剂狂犬病疫苗有着根本的优越性。

4参考文献

[1]林海祥，俞永新．皮卡佐剂狂犬病疫苗的有效性．中国生物制品学杂志，2010，23：1028-1031．doi:10.13200/j.cjb.2010.09.121.linhx.014.

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[8]林海祥，俞永新．狂犬病疫苗的效力测定及参考标准品的发展．微生物学免疫学进展，1987,3:1-4.

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[11]林海祥，俞永新．皮卡佐剂和皮卡狂犬病疫苗的安全性．中国生物制品学杂志，2010，23：98-100.doi: 10.13200/j.cjb.2010.01.104.linhx.024.

通信作者：林海祥，Email: haixianglin510@sina.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.010

基金项目：重大新药创制项目(人用皮卡狂犬病疫苗：2013ZⅩ09102034)

(收稿日期：2016-01-08)

TheeffectstreatedwithPICKCarabiesvaccinetomiceandbeagledogsinfectedrabieswildvirusesandvolunteersimmunizedwithPICKCarabiesvaccine

Lin Haixiang，Xu Gelin，Wu Jie，Zhang Shoufeng，Hu Rongliang，Li Lietao，Liu Fang，Zhang Shirui，Zhang Yi

Beijing Yisheng Xingye Bio-tech Co.,Ltd, Beijing 102600,China(Lin HX, Li LT,Liu F,Zhang SR, Zhang Y); Wuhan Institute of biological products, Wuhan 430207China(Xu GL, Wu J); Institute of Military Veterinary, Academy of Military Medical Sciences, Changchun 130117, China(Zhang SF, Hu RL).Corresponding author:Lin Haixiang, Email:haixianglin510@sina.com

【Abstract】ObjectiveTo test the immune therapeutic effects of PICKCa adjuvant rabies vaccine for the post-exposure mice and beagle dogs and immune memory effect for human. MethodsFor the mice and beagle dogs first to infect with rabies wild virus and then immunize with PICKCa rabies vaccine.For volunteers, first to immunize with PICKCa rabies vaccine after 2.5 years to take peripheral blood mononuclear cell and then to check cells secreted interferon-� with flow cytometry. ResultsIn 3 independent assays of post-explosure immunization of mice and beagle dogs PICKCa rabies vaccine were much better then commercial adjuvant-free rabies vaccines, the protective rate from 20%-30% to 70%-100% Also, in the assay of cells secreted IFN-γ by peripheral blood mononuclear cells from volunteers immunized by PICKCa rabies vaccine the IFN-γ cell levels were much higher than control. ConclusionsCompared with commercial adjuvant-free rabies vaccines the PICKCa rabies vaccine had significant immune therapeutic effects in the mice and dogs. Also PICKCa rabies vaccine had good immune memory effect in human.

【Key words】PICKCa adjuvant; Rabies vaccines; Immune memory; Post exposure immunity