水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的克隆及原核表达

陈亚红，刘早利，王春台，刘新琼

（中南民族大学生命科学学院/武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室/生物技术国家民委重点实验室，湖北 武汉 430074）

水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的克隆及原核表达

陈亚红，刘早利，王春台，刘新琼

（中南民族大学生命科学学院/武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室/生物技术国家民委重点实验室，湖北 武汉 430074）

水稻OsSSI2基因负调控水稻的抗病反应，为了研究该基因的抗性机理，构建pGEX-6P1-OsSSI2原核表达载体，转化大肠杆菌BL21细胞后利用IPTG诱导外源蛋白表达并优化表达条件，使用SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物。结果表明：成功构建了pGEX-6P1-OsSSI2原核表达载体后进行原核表达，在IPTG浓度为0.3 mmol/L，温度为25℃，诱导表达7 h，通过SDS-PAGE和Western Blot检测发现OsSSI2蛋白的可溶性表达量最多，为进一步研究水稻OsSSI2蛋白的抗性机理奠定了基础。

水稻；OsSSI2基因；原核表达载体；诱导表达

陈亚红，刘早利，王春台，等.水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的克隆及原核表达［J］.广东农业科学，2016，43（4）：33-37.

稻瘟病是由真菌Magnaporthe oryzae 引起的水稻病害，是全球最具影响力和破坏力的水稻病害之一［1］。目前，稻瘟病的防治主要采用化学防治和抗病新品种培育两种途径。化学防治通常成本高、效果差而且污染环境。因此发掘水稻自身的广谱抗性基因资源，培育持久高抗品种，是最经济有效的病害控制措施［2-3］，但对于水稻的广谱抗性机理不甚清楚。

植物在抗病过程中通过激活不同的防御通路来对抗病原体感染，其中水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）等植物激素是诱导植物抗病反应的重要的信号分子［4-5］。每种激素调节不同的防御通路但相互配合。除了植物激素，一些研究也表明脂肪酸（FA）及其衍生物在植物抗病反应中也起着重要作用，扮演了一个重要信号分子的作用。已经有报道证明，抑制硬脂酰-ACP去饱和酶基因（SACPD）的表达提高了拟南芥（SSI2）和大豆对多种病原体的抗性［6-8］。

OsSSI2基因是脂肪酸去饱和基因SSI2在水稻中的同源基因，OsSSI2的RNAi转基因水 稻表现对稻瘟病及白叶枯的广谱抗病性，说明OsSSI2基因参与并且负调控水稻的抗病反应［9-13］。因此该基因是研究广谱抗性机理的一个很好材料。本研究以前期得到的水稻OsSSI2基因为对象，构建pGEX-6P1-OsSSI2原核表达载体并尝试不同的表达条件，得到可溶性GST-OsSSI2融合蛋白，以期为下一步获取与OsSSI2蛋白相互作用的蛋白及研究该蛋白的抗性机理奠定基础。

1 　材料与方法

1.1 试验材料

原核表达载体pGEX-6P-1，大肠杆菌菌株BL21和DH5α由中南民族大学国家民委生物技术重点实验室提供。

限制性内切酶BamH I、EcolR I，DNA分子量Marker，购自宝生物工程有限公司（大连）；PCR扩增酶KOD，连接酶Ligation high都购自TOYOBO公司（日本）；Pageruler®Prestained 预染蛋白分子量Marker购自FERMENTAS公司（美国）；凝胶回收试剂盒、凝胶清洁试剂盒与反转试剂盒均购自Axygen公司（美国）；Anti-GST Antibody 抗体和二抗购自天根生化科技有限公司（北京）和Abbkine公司（美国）；超敏ECL化学发光即用型底物购自博士德生物公司（武汉）；引物合成及测序都在金斯瑞生物有限公司（南京）进行。

1.2 pGEX-6P1-OsSSI2原核表达载体的构建

以OsSSI2质粒DNA为PCR扩增模板，限制性内切酶BamH I、EcoR I为酶切位点设计引物，利用PCR反应扩增出目的片段，引物为：

OsSSI26P-1-BamH IF：5'-GATAggatccGCGTC GAGGATGGCGCTCC-3'

OsSSI26P-1-EcoR IR：5'-GCGAgaattcGAGTTG AACTTCCCTACC-3'

(1)大学生企业家精神和创业价值观培育情况普遍一般。在对10所省属公办本科高校大学生创业教育调研中发现只有1所高校大学生企业家精神和创业价值观培育情况较好，另外9所高校情况一般；在对10所湖北省属民办本科高校大学生创业教育调研中发现只有2所高校情况较好，另外8所高校情况一般；而其他3种类型的高校在该指标上都表现一般。

采用20 μL体系，共3管进行PCR反应，各反应物用来如下：ddH2O 4.2 μL、2×KOD buffer 1.0 μL、OsSSI26P-1-BamH IF（10 μmol/L）0.6 μL、OsSSI26P-1-EcoR IR（10 μmol/L）0.6 μL、dNTP（2.5 mmol/L）3.2 μL、模板DNA 1.0 μL、KOD 0.4 μL、总体积 20.0 μL。

PCR反应程序：94℃预变性2 min；94℃变性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸2.0 min，重复34个循环，68℃延伸10 min。扩增反应完成后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。使用清洁回收试剂盒对目的片段进行清洁回收，然后用限制性内切酶BamH I和EcoR I同时双酶切目的片段和pGEX-6P1空载体，37℃酶切2 h。使用凝胶回收试剂盒对酶切的目的片段及载体片段进行切胶回收，16℃用Ligation high连接酶连接OsSSI2目的片段和pGEX-6P1载体片段2 h后转化DH5α感受态细胞，涂Amp+平板后于37℃恒温培养箱倒置过夜培养。从平板上随机挑取单克隆，提取质粒并且进行PCR及双酶切鉴定，鉴定结果为阳性的单克隆送公司测序。

1.3 重组蛋白的原核表达

1.3.1 重组蛋白的诱导表达 将构建好的pGEX-6P1-OsSSI2的重组质粒和pGEX-6P1载体转化BL21表达菌株，涂Amp+平板后于37℃恒温培养箱倒置过夜，随机挑取6个单克隆菌落接种于3 mL含Amp+的液体 LB培养基中，于37 ℃摇床中180 r/min振荡培养12 h作为种子液，按1∶1000的接种量接种至5 mL含Amp+的液体 LB培养基中，37 ℃摇床中180 r/min振荡培养至OD600约为0.6，保存菌液后加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，于37℃振荡培养3 h诱导蛋白的表达。同时诱导不加IPTG的pGEX-6P1-OsSSI2和pGEX-6P1空载体的BL21菌株作为阴性对照。

1.3.2 重组蛋白的诱导表达条件的优化 选取上一步中表达量较好的一个克隆，用保存的菌液按1∶1000的接种量接种至5 mL含Amp+的液体 LB培养基中，37℃摇床中180 r/min振荡培养至OD600约为0.6后，分别加入IPTG至终浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L诱导表达确定IPTG浓度后，分别于10、15、25、37℃条件下诱导蛋白表达，分别于1、3、5、7 h诱导时间取样5 mL，利用SDS-PAGE电泳检测比较诱导温度和时间对可溶性蛋白表达的影响。

1.3.3 重组蛋白的SDS-PAGE检测 将诱导表达完成的菌液转入离心管中，4 000 r/min离心10 min，弃上清收集菌体，加入3 mL PBS（pH7.4）缓冲液重新悬浮菌体，在冰浴中超声波破碎细胞，破碎5 s，间隔5 s，每管破碎10 min，4 000 r/min离心15 min收集蛋白上清，在沉淀中加入1 mL bufferB，室温静置1 h，间隔震荡几次，12 000 r/min离心15 min，取上清为蛋白沉淀。各取上清100 μL加入适量Loading buffer于100℃沸水中煮10 min，瞬时离心后进行10% SDS-PAGE检测。恒压100 V电泳，用考马斯亮蓝染色液染色3 h后用脱色液进行脱色。

2 　结果与分析

2.1 pGEX-6P1-OsSSI2原核表达载体的克隆

将重组质粒pGEX-6P1-OsSSI2通过PCR鉴定，OsSSI2大小为1 197 bp（图1A）；通过双酶切鉴定显示，重组质粒经过BamH I和EcoR I双酶切，得到两段大小分别为5 000、1 200 bp左右大小的条带，与预期估计条带大小相同（图1B）。将构建好的载体送公司测序，其测序结果100%匹配，说明pGEX-6P1-OsSSI2原核表达载体构建成功。

图1 重组表达载体阳性克隆鉴定

2.2 重组蛋白的SDS-PAGE检测

将构建好的pGEX-6P1-OsSSI2的重组质粒和pGEX-6P1载体转化BL21表达菌株，随机挑取6个单克隆菌落进行诱导表达，用SDS-PAGE检测表达产物，经染色和脱色后观察，目的蛋白大小约为44.4 ku，GST标签大小约为26 ku，所以表达目的蛋白大小约为70.4 ku，从图2可见，在70 ku左右，诱导处理后的样品与空载蛋白存在明显差异，表明OsSSI2蛋白可能高效表达，其中2、3、7号克隆蛋白表达量较高，可用于下一步蛋白表达条件摸索。

图2 含GST标签的OsSSI2融合蛋白的诱导表达SDS-PAGE检测

利用表达量较高的克隆进行蛋白表达IPTG浓度的摸索，发现该蛋白同时在上清和沉淀都有表达，当IPTG浓度为0.3 mmol/L时，上清中可溶性蛋白表达量最高，因此我们确定IPTG终浓度为0.3 mmol/L（图3）。

图3 不同浓度 IPTG诱导pGEX-6P1-OsSSI2蛋白表达SDS-PAGE检测

在蛋白表达IPTG终浓度为0.3 mmol/L时，进行表达温度和时间的优化，经过10、15、25、37℃不同温度，1、3、5、7 h不同时间的摸索，确定25℃、7 h为最佳表达条件（图4）。

图4 不同温度时间诱导pGEX-6P1-OsSSI2蛋白表达SDS-PAGE检测

综上所述，确定目的蛋白较适宜的诱导表达条件为：IPTG终浓度为0.3 mmol/L、诱导温度和时间为25℃、7 h。

2.3 重组蛋白的Western Blot检测

用GST单抗对诱导表达的蛋白孵育进行检测，可以观察到在20 ku和35 ku之间空载体及诱导后重组蛋白均有，分析该条带为GST条带。在70 ku附近，诱导处理后的pGEX-6P1-OsSSI2上清、沉淀中均出现单一的信号条带，而未加IPTG诱导的pGEX-6P1-OsSSI2和空载体的蛋白样品中未见信号表达（图5）。此结果进一步表明载体构建成功，水稻OsSSI2蛋白成功并高效的表达，并且该外源蛋白有可溶性和包涵体两种表达形式。

图5 OsSSI2蛋白Western Blot检测

3 结论与讨论

本试验采用pGEX-6P1原核表达载体，在目标蛋白的N端加上一个约26 ku的GST标签蛋白，在原核表达时优化诱导表达条件，从不同的IPTG浓度、诱导温度、诱导时间去摸索，结果在表达条件为IPTG终浓度为0.3 mmol/L、诱导温度为25℃、诱导时间为7 h时提高了目的蛋白的可溶性表达，为进一步去研究OsSSI2蛋白在水稻中的相关功能奠定了基础。

在原核细胞表达外源基因过程中，尤其是以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞质内聚集，形成包涵体。以包涵体形式存在的蛋白质分子不具有正确的天然三维结构，表达蛋白不具有生物活性，需要通过复性操作以得到具有预期生物活性的蛋白质。而通常的包涵体复性过程中，复性条件难以控制，成本高，在复性过程中也很难保证包涵体蛋白形成正确的折叠结构，为后续的研究提供了诸多的不便［18-19］。外源表达OsSSI2蛋白时发现目的蛋白仍然以部分包涵体形式存在，而如果能从上清中表达出大量可溶性的OsSSI2蛋白则会避免这个问题，于是在原核表达时优化诱导表达条件，最终提高了目的蛋白的可溶性表达。

本研究室在前期研究中，通过酵母双杂交技术初步筛选到与OsSSI2蛋白互作的潜在的互作蛋白，为了进一步研究其互作关系，本研究克隆该目的基因并利用原核表达成功表达出可溶性目的蛋白，下一步将进行两个互作蛋白体外Pull-down的验证，这对其抗病机理的研究具有重要意义。

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（责任编辑 杨贤智）

Cloning and prokaryotic expression of broad-spectrum resistance negative control gene OsSSI2 from rice

CHEN Ya-hong，LIU Zao-li，WANG Chun-tai，LIU Xin-qiong
（Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China/Key Lab for Biotechnology of State Ethnic Affairs Commission /College of Life Science，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China）

The rice OsSSI2 gene regulates negatively rice disease resistance.In order to dissect the resistance mechanism of OsSSI2，the recombinant prokaryotic expression vector pGEX-6P1-OsSSI2 was constructed and transformed into E.coli strain BL21.The OsSSI2 protein was induced with IPTG，and confirmed by SDS-PAGE and Western Blot analysis.The results revealed that the prokaryotic expression vector pGEX-6P1-OsSSI2 was constructed and expressed successfully.In the condition that IPTG concentration was 0.3 mmol/L，the temperature was 25℃，and the time induced expression was 7 h，maximum expression of OsSSI2 soluble protein was detected by SDS-PAGE and Western Blot，which laid the foundation for further research of resistance mechanism of OsSSI2 protein from rice.

rice；OsSSI2；prokaryotic expression vector；induced expression

S511.01

A

1004-874X（2016）04-0033-05

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.04.008

2015-11-02

国家自然科学基金（31370306）；湖北省自然科学基金重点项目（2013CFA098）

陈亚红（1989-），女，在读硕士生，E-mail：896826843@qq.com

刘新琼（1972-），女，博士，教授，E-mail：liuxinqiong@mail.scuec.edu.cn