HPLC-MS法测定米酒中的甜蜜素含量

张倩勉（广西-东盟食品药品安全检验检测中心，广西南宁530021）

HPLC-MS法测定米酒中的甜蜜素含量

张倩勉
（广西-东盟食品药品安全检验检测中心，广西南宁530021）

摘要：通过HPLC-MS方法，同时采用正负离子模式进行多反应检测（MRM），对米酒中的甜蜜素进行测定。结果表明，该方法的标准曲线线性良好，相关系数r=0.9998，检出限（3S/N）为0.1 μg，回收率在85.4%～97.8%之间，RD值为2.9%～4.5%。该方法快速、简便、灵敏、准确，适宜于米酒中甜蜜素的快速测定。

关键词：HPLC-MS；米酒； 甜蜜素；含量

甜蜜素（sodium cyclamate），化学名为环己基氨基磺酸钠，是食品生产中常用的合成甜味剂之一，广泛应用于各类食品。酒是粮食或水果经发酵而成的饮料产品，富含人体需要的营养成分，适量饮用可预防多种疾病。随着我国人民生活水平的提高，酒的消费量呈现了快速增长的趋势，同时人们对酒中添加的人工合成甜味剂安全性的关注也越来越高［1-3］。GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》明确规定，除了在配制酒中可以使用甜蜜素，而且最大使用量为0.65 g/kg外，在蒸馏酒和发酵酒中均不得使用甜蜜素。但是甜蜜素滥用现象时有发生，如果长期食用甜蜜素超标的食品，就会因摄入过量而对人体造成危害。因此监测和评估甜蜜素的风险非常重要。目前测定酒中甜蜜素的方法，主要有液相色谱法［4-6］、气相色谱法［7-10］、LC-MS法［11-19［20］、离子色谱法［21-23］、分光光度法［24］。由于酒中成分复杂，存在的干扰物质较多，使得检测结果容易出现假阳性。本试验采用HPLC-MS法测定米酒中甜蜜素的含量，主要通过正负离子两种模式进行多反应检测，物质色谱峰的保留时间与标准工作液相应化合物的保留时间一致，且样品谱图中组分定性定量离子的相对丰度比与浓度相当标准工作液谱图中对应组分的定性定量离子的相对丰度比一致，允许偏差参照欧盟标准（2002/657/EC）。使用该方法测定米酒中甜蜜素的含量更为准确、灵敏、高效。

1　材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

米酒，抽检；甜蜜素对照品，纯度≥98.0%，xStandard公司；乙酸、甲醇均为色谱纯；水为超纯水。

仪器设备：Agilent-1260高效液相色谱-Triple Quad 5500质谱仪，美国AB公司；S205DU分析天平。

1.2实验方法

1.2.1对照品储备液

准确称取甜蜜素111.56 mg，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，即得甜蜜素对照品储备液，浓度为10.93 mg/mL。

1.2.2对照品工作液

精密量取对照品储备液1 mL，置于100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀（浓度为109.3 μg/mL），精密量取该溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得对照品工作液（浓度为1.093 μg/mL）。

1.2.3标准曲线

取5个10 mL容量瓶，分别加入对照品工作液0.1 mL、0.3 mL、0.6 mL、1.2 mL、2.0 mL，加水定容至刻度，摇匀，即得曲线L1、L2、L3、L4、L5，甜蜜素浓度分别为10.93 ng/mL、32.80 ng/mL、65.58 ng/mL、131.2 ng/mL、218.7 ng/mL。

1.2.4色谱条件

色谱柱：XBridge-C184.6 mm×75 mm，2.5 μm；流动相组成为0.1%乙酸水溶液-甲醇，流速：0.4 mL/min；柱温30℃；进样量：5 μL。梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1　流动相洗脱程序

1.2.5质谱条件

1.2.5.1负离子模式

离子源：电喷雾离子源；检测方式：MRM；气帘气流速：35 L/min；离子源温度：650℃；碰撞气流速：6 L/min；喷雾电压：-4500V；辅助气流速：50 L/min；其余质谱条件见表2。

1.2.5.2正离子模式

离子源：电喷雾离子源；检测方式为多反应监测（MRM）；气帘气流速：35 L/min；离子源温度：650℃；碰撞气流速：6 L/min；喷雾电压：5500 V；辅助气流速：50 L/min；其余质谱条件见表2。

表2　甜蜜素检测的质谱条件

1.2.6样品处理

1.2.6.1供试品溶液制备

取10 mL容量瓶，精密加入供试品10 mL，用水浴加热氮吹仪除去乙醇，冷却后，用水定容至刻度，摇匀，然后用0.22 μm滤膜过滤，滤液待上机分析。

1.2.6.2加标回收率实验

取6个10 mL容量瓶，精密加入空白供试品10 mL，用水浴加热氮吹仪除去乙醇，冷却后，分为3组，分别加入0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL对照品工作液，并用水定容至刻度，摇匀，然后用0.22 μm滤膜过滤，滤液待上机分析。

1.2.6.3检出限溶液制备

取2个10 mL容量瓶，精密加入空白供试品10 mL，用水浴加热氮吹仪除去乙醇，冷却后，加入0.1 mL对照品工作液，并用水定容至刻度，摇匀，然后用0.22 μm滤膜过滤，滤液待上机分析。

1.2.6.4样品测定方法

将处理好的待测液放入自动进样器的样品盘上，进样器自动进样1 μL，数据采集采用Analyst Software工作站进行采集处理，采用Quantitative Analysis软件进行数据处理，使用外标法进行数据分析，得出样品溶液中甜蜜素的质量浓度。再根据以下公式得出检测结果。

结果计算公式：

式中：W为样品中甜蜜素（以环己基氨基磺酸计）的含量（μg/L）；C为测得浓度（ng/mL）；V为稀释倍数；M为样品取样量（mL）；0.891为环己基氨基磺酸钠与环己基氨基磺酸的换算系数。

2　结果与分析

2.1质谱与色谱条件的选择

将含有1 μg/mL的甜蜜素标准溶液在正离子和负离子模式下进行全扫描，找到最佳的电离模式。结果表明在正负离子模式下，各有一对离子响应较强，分别选择［M-Na］以及［M+H］作为母离子，进行碰撞能量的优化。以负离子模式下的离子对作为定量离子。质谱条件见表2。本实验用含0.1%乙酸的水溶液和甲醇作为流动相，由于酒中成分复杂，故采用梯度洗脱，使目标化合物能更好地与其他干扰物质分离。

2.2线性关系

把标准品曲线注入液相质谱联用仪，以峰面积为（Y）轴，相对质量浓度为（X）轴建立标准曲线，并求出回归方程，结果见图1。结果显示，用液相色谱串联质谱检测甜蜜素在10～200 ng/mL范围内线性关系良好，R为0.9998，能够满足定量分析的需要。结果偏差参照欧盟标准（2002/657/EC），检验结果用定性定量离子峰面积比进行判定。从所测得待测物的结果显示，定性定量离子峰面积比在标准曲线相应的定性定量离子峰面积比规定的标准偏差范围内。所参照的标准偏差见表3，线性关系及结果见图1、表4。

表3　 欧盟标准偏差

2.3回收率

回收率实验结果表明，添加不同浓度的甜蜜素，回收率在85.4%～97.8%之间，RD值为2.9%～4.5%。而且回收率结果的定性定量离子峰面积之比均在欧盟标准规定的偏差范围内。结果见表5。

2.4样品检测结果

按照1.2.6对样品进行前处理，然后进样分析。用负离子模式的离子对为定量离子，并通过定性定量离子峰面积之比，参照欧盟标准偏差对结果进行判定，最后根据标准曲线采用外标法定量，计算样品中甜蜜素（以环己基氨基磺酸计）的含量，结果见表6。

图1　甜蜜素标准曲线图

表4　标准曲线、待测样品、回收率以及检出限正负离子峰面积的关系

表6　米酒中甜蜜素的测定结果

2.5方法检出限

在本实验条件下，在空白样品中添加标准溶液进行测定，以质谱仪3倍信噪比计算目标物组分的检出限为0.1 μg，而且其正负离子峰面积之比在所参考的标准偏差范围内。

表5　线性关系、相关系数和标准加入回收率

3　结论

本研究建立了米酒中甜蜜素的高效液相色谱串联质谱检测方法，同时采用正负离子模式进行多反应监测，并参照欧盟标准偏差，大大减少了结果的假阳性概率，定性的准确性大幅提高。该方法便于操作，灵敏度、重现性良好，检出限低，可作为米酒中甜蜜素的确证分析。

参考文献：

［1］李晓瑜.非营养性甜味剂的安全性研究进展及管理现状（综述）［J］.中国食品卫生杂志，2002，14（4）：43-45.

［2］鲁琳，杭义萍，高燕红，等.食品甜味剂分类及其检测技术现状［J］.现代预防医学，2009，36（11）：2033-2035.

［3］朱兴江，丁振华，方猛，等.人工合成甜味剂与防腐剂的现状及发展趋势［J］.食品工业科技，2009，30（8）：340-345.

［4］臧光楼，董明盛.白酒中甜蜜素检测方法的研究［J］.食品科学，2009，30（10）：361-364.

［5］邵铁锋，李雪岷，陈勤伟，等.高效液相色谱法测定酒中甜蜜素［J］.中国酿造，2004（12）：31-32.

［6］刘渭萍，雷雅娟.高效液相色谱法快速测定葡萄酒及果酒中的防腐剂和甜昧剂［J］.辽宁化工，2006，35（4）：238-239

［7］陈玉波，苏建国，薛银飞，等.气相色谱毛细管柱内标法测定白酒中甜蜜素含量［J］.淮阴工学院学报，2009，18（1）：65-68.

［8］张丽薇，马莹，蒋素，等.气相色谱法测定葡萄酒中的甜蜜素［J］.中国卫生检验杂志，2009，19（12）：2807-2808.

［9］李锋格，窦辉，姚伟琴，等.毛细管气相色谱法测定葡萄酒中甜蜜素［J］.中国卫生检验杂志，2005，15（6）：707-708.

［10］张燕，赵永福，许红.葡萄酒中环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）的气相色谱法测定［J］.葡萄酿酒，2003（3）：54-55.

［11］王震，石丽珠.超高效液相色谱-串联质谱测定饮料和酒中防腐剂与甜味剂［J］.食品安全质量检测学报，2014，5（4）：1179-1184.

［12］周彬，吕任一，肖丽恒，等.超高效液相色谱串联质谱同时测定酒类产品中多种人工合成甜味剂［J］.食品科学，2014，35（12）：218-222.

［13］徐春祥，秦金平.液相色谱-质谱联用直接测定白酒中甜蜜素［J］.食品与发酵工业，2006，32（2）：106-107.

［14］国家认证认可监督管理委员会.出口食品环己基氨基磺酸钠的检测方法液相色谱-质谱/质谱法：SN/T 1948—2007 ［S］.北京：中国标准出版社，2007.

［15］吴世嘉，王洪新，陶冠军.超高压液相色谱-质谱同时测定白酒中6种微量甜味剂的方法研究［J］.食品与生物技术学报，2010，25（5）：670-675.

［16］肖晶，方从容，杨大进，等.高效液相色谱-质谱法测定酒中甜蜜素含量的研究［J］.中国食品卫生杂志，2013，25（3）：254-256.

［17］王骏.HPLC/MS测定白酒中的微量甜味剂［J］.食品与发酵工业，2007，33（10）：152-154.

［18］秦昉，王林祥，陶冠军.液质联用法同时测定黄酒中糖精钠和甜蜜素［J］.酿酒科技，2005（9）：84-86.

［19］郭莹莹，乔善磊，李磊，等.白酒和调香剂中四种人工合成甜味剂的UPLC-MS-MS测定［J］.食品科学，2010，31（14）：245-249.

［20］姜文良，钱玉根，杨民.GC-MS法测定黄酒中的甜蜜素［J］.中国食品添加剂，2008（5）：156-158.

［21］李红艳.白酒中甜蜜素的无衍生离子色谱法检测［J］.分析测试学报，2010，29（8）：859-863

［22］温雅，赵丹莹.白酒中甜蜜素的固相萃取离子色谱测定法［J］.职业与健康，2010，26（15）：1712-1713.

［23］郭蒙京，温雅，赵丹莹.红葡萄酒中甜蜜素的固相萃取离子色谱测定法［J］.职业与健康，2010，26（2）：161-162.

［24］黄会秋.分光光度法间接测定白酒中甜蜜素［J］.中国卫生检验杂志，2006，16（9）：1073-1074.

优先数字出版时间：2016-03-23；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160323.1530.006.html。

中图分类号：TS262.4；TS261.4；TS261.7

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）07-0116-03

DOI：10.13746/j.njkj.2016002

收稿日期：2016-01-06

作者简介：张倩勉（1981-），女，广西北海人，硕士研究生，工程师，研究方向：食品安全检测。

Determination of Sodium Cyclamate Content in Rice Wine by HPLC-MS

ZHANG Qianmian
（Guangxi&ASEAN Inspection&Testing Center For Food and Drug Safety，Nanning，Guangxi 530021，China）

Abstract:Sodium cyclamate content in rice wine was measured by HPLC-MS coupled with the positive and negative ions modes of MRM. The results showed that a good linearity was obtained for the standard curve of the method，its correlation coefficient was high（r=0.9998），its detection limit was 0.1 μg（3S/N），its recovery rate was between 85.4%-97.8%，and RD value was 2.9%-4.5%.This method was rapid，simple，sensitive and accurate，and it was a suitable method for rapid determination of sodium cyclamate content in rice wine.

Key words:HPLC-MS；rice wine；sodium cyclamate；content