Toll样受体在新生儿呼吸窘迫综合征中作用的研究

熊 维,蒲向阳，李晓文

(1.重庆市酉阳县人民医院儿科 409800；2.重庆市黔江区中心医院儿科 409000；3.重庆医科大学附属儿童医院新生儿科 400014)

Toll样受体在新生儿呼吸窘迫综合征中作用的研究

熊 维1,蒲向阳2△，李晓文3

(1.重庆市酉阳县人民医院儿科 409800；2.重庆市黔江区中心医院儿科 409000；3.重庆医科大学附属儿童医院新生儿科 400014)

目的 探讨Toll样受体在新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)中的作用。方法 选取酉阳县人民医院2014年10月至2015年10月的42例NRDS患儿作为病例组，选取同期的42例非NRDS患儿作为对照组，对两组研究对象的TLR2、TLR3和TLR4、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、JNK和核因子-κB(NF-κB)血清学水平进行检查，TLRs/JNK/NF-κB/TNF-α信号通路进行表达，分析TLR2、TLR3和TLR4血清学水平与NRDS发病的相关性，以及TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB与NRDS发病的相关性。结果 两组患者的治疗后3 d和7 d的TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB血清学水平与治疗前存在明显差异，而且病例组的TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB血清学水平与对照组差异有统计学意义(P<0.05)；两组患者治疗后3 d和治疗后7 d的TLR2、TLR3和TLR4明显低于治疗前，而且病例组治疗后3 d和治疗后7 d的TLR2、TLR3和TLR4明显低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB血清学水平与NRDS发病具有良好的相关性，TLR2、TLR3和TLR4与NRDS发病具有良好相关性。结论 对NRDS的Toll样受体分析可以更好的发现TLRs/JNK/ NF-κB/TNF-α信号通路与新生儿呼吸窘迫综合征的相关性。

Toll样受体；呼吸窘迫综合征，新生儿；肺表面活性物质；TLRs/JNK/ NF-κB/TNF-α信号通路

新生儿呼吸窘迫综合征(neonatal respiratory distress syndrome，NRDS)是出生新生儿的一种常见的呼吸道重症，而且也是早产儿常见的临床表现，也是导致新生儿死亡的重要原因。相关的资料显示NRDS是新生儿在出生一年内容易患上的疾病[1-2]。此外，NRDS也是我国NICU住院期间平均费用是新生儿呼吸衰竭疾病谱中最高[3-4]。目前一致认为肺表面活性物质(pulmonary surfactant，PS)缺乏是NRDS的发病机制[5]。PS相关蛋白是肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的一个重要标志物，SP-A与急性呼吸窘迫综合征(ARDS)具有良好的负相关，而且SP-A水平下降也可以说明ARDS也会严重发生，可能的原因是SP-A可以抑制C1q介导的补体活化和炎性反应，而且还可以与先天免疫的Toll样受体(TLRs)有着一定关系。目前有关TLRs与ARDS的研究已见很多报道，而NRDS中TLRs的表达情况鲜有报道。对NRDS固有免疫功能的因子如粒细胞、单核巨噬细胞数量的研究可为进一步了解在该病的发生，而且对发展过程中的特异免疫TLRs、TNF-α、IL-6等相关因子具有一定参考。因此，本课题通过对NRDS患儿体内外周血免疫细胞有关TLRs信号通路分子的检测统计分析，探讨血清TLRs(TLR2～4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、JNK和核因子-κB(NF-κB)水平与NRDS发生之间的关系，分析其参与NRDS发病的机制，并进一步观测患儿的预后，探讨TLRs与患儿病情的相关性，以寻求合适有效的指标预测病情。

表1 两组患者的TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB的比较

a:P<0.05，与治疗前比较。

表2 两组患者的TLR2、TLR3和TLR4的比较

a：P<0.05，与治疗前比较；b：P<0.05，与对照组比较。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2014年10月至2016年1月酉阳县人民医院新生儿科收治的诊断为NRDS的患儿共42例作为病例组，其中，男25例，女17例，出生1～5 d，平均(1.1±2.7)d；并将同期住院的42例非NRDS患儿为对照组，其中，男24例，女18例，出生1～11 d，平均(5.6±2.5)d。

1.2 纳入标准和排除标准[6]入组病例填写病例收集信息表和知情同意书。纳入标准：(1)出生后6 h内出现呼吸困难，并伴有呼气呻吟、低氧血症表现的患儿；(2)试验的胃液泡沫显示阴性的患儿；(3)胸片检查显示肺透气度降低和细颗粒状。排除标准：(1)血液或其他体液培养显示阳性、白细胞增高或降低、C反应蛋白(CRP)增高等发生感染的患儿；(2)伴有先天性疾病的患儿；(3)肺和胸壁畸形；(4)临床怀疑为代谢性疾病；(5)新生儿脑病。

1.3 方法

1.3.1 指标检测[7]所有研究对象，均在纳入试验后第2天清晨未进食前进行静脉采血。等血液凝固后采用4 000 r/min离心10 min，分离血清并放置于Eppendorf管中，-40 ℃冷冻保存待用。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。采用流式细胞术检测TLRs，具体步骤如下：取乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝的全血100 μL，分别加入20 μL PE标记的鼠抗人TLRs单克隆抗体，混匀后室温避光孵育30 min；用QPREP标本处理仪进行白细胞固定和红细胞破膜，室温避光10 min，离心后弃去上清液；用2 mL 固定洗涤液洗涤2次后弃去上清液；用500 μL洗涤液重悬后就可以采用流式细胞仪行检测。

1.3.2 血常规检查 研究对象静脉采血后进行白细胞计数，特别是中性粒细胞和淋巴细胞(各亚群)检测，并记录收集实验数据。

1.3.3 记录患者的预后 所有患儿采用相同的治疗方法治疗后记录患者不同时间点的预后情况。

1.4 观察指标 (1)由股静脉抽血采集血样，血常规计数、WBC、PMN和淋巴细胞计数，ELISA法和流式细胞仪检测对照组和NRDS组研究对象血清中TLR2、TLR3和TLR4的表达情况；(2)ELISA检测血清中TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB的变化情况；(3)检测NRDS组经治疗后3 d和7 d的TLR2、TLR3和TLR4血清学水平。

2 结 果

2.1 两组患者TNF-α、IL-6、JNF和NF-κB比较 两组患者的治疗后3 d和7 d的TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB血清学水平与治疗前存在明显差异，而且病例组的TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB血清学水平与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 两组患者的TLR2、TLR3和TLR4的比较 两组患者治疗后3 d和治疗后7 d的TLR2、TLR3和TLR4明显低于治疗前，而且病例组治疗后3 d和治疗后7 d的TLR2、TLR3和TLR4明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 影响NRDS的Logistic回归分析 TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB血清学水平与NRDS发病具有良好相关性，以及TLR2、TLR3和TLR4与NRDS发病具有良好相关性,见表3。

表3 影响NRDS的Logistic回归分析

3 讨 论

NRDS的发生与肺表面活性物质上的蛋白有一定关系。肺表面活性物质是由磷脂、蛋白质和中性脂肪组成，并通过肺泡Ⅱ型细胞合成、贮存及分泌[8]，可以明显降低气道中气液界面的表面张力，防止肺泡和细支气管发生萎陷，并且保持气道的开放状态。SP-A是一种最先在肺泡Ⅱ型上皮细胞中强烈表达的蛋白，而且其含量很丰富。此物质的表达与呼吸窘迫综合征的发生有密切关系，相关的报道也表明了肺表面活性物质上TLRs的表达影响呼吸窘迫综合征的发生，其严重程度需要进一步考究。TLRs的表达主要在抗原提呈细胞，以及与先天性免疫相关的中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞有关。

TLRs是一种类似微生物的病原体侵入机体后就会激活细胞而产生免疫防御的天然免疫受体[9]。当前TLR家族共有11个受体，分布于人体的各个器官的细胞中，并对不同的病原体发挥不同免疫防御作用。TLR2和TLR4是代表性受体，当病原体入侵人体，以及天然免疫经TLR受体激活就会诱发的炎性反应，TLR2和TLR4在这种免疫反应中具有主导作用[10]。TLR-2主要识别革兰阳性细菌膜的结构，对此微生物比较敏感，而TLR-3 主要参与非感染性 ARDS 的病理反应，对ARDS 引起的感染不敏感，TLR-4 是与内毒素(LPS)结合的受体，对毒素近期的感染比较敏感[11]。NRDS是否也通过 TLR 的信号转导目前还未见报道。但是有研究认为，Toll样受体与胎龄和窒息、缺血缺氧性脑病、新生儿感染、慢性肺损伤等疾病的发生有关。因此本研究中TLR2、TLR-3 和TLR4随着治疗时间的延长，就会越来越低，也说明患者的病情也逐渐减少。

当机体出现感染或疾病后，TLRs和配体就会很快结合，并产生信号转导的级联反应，引起转录因子NF-κB和C-Jun氨基末端激酶的转录反应，这种反应会诱导促炎症细胞因子的产生，并激活抗微生物发生天然免疫应答[12]，从而达到免疫防御的作用。新生儿由于各种器官发育不完全、不成熟，于是特异的免疫功能就不健全，因此，更容易因为病原体的感染而发生疾病，而目前NRDS中TLRs的表达情况鲜有报道。对NRDS固有的免疫功能如粒细胞、单核巨噬细胞数量和功能进行研究，可以进一步了解该病的发生发展过程中TLRs、TNF-α、IL-6等相关免疫因子的变化，从而更深入的研究TLRs与NRDS的关系具有重要作用。当患者患病后患者的炎性因子也会升高，通过治疗后3 d和7 d的TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB血清学水平与治疗前存在明显差异。

本研究通过对NRDS患儿体内外周血免疫细胞相关的TLRs信号通路分子的检测进行统计分析，发现血清TLRs(TLR2～4)、TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB水平与NRDS发生具有良好的关系。而且NRDS的TLRs(TLR2-4)、TNF-α、IL-6、JNK和NF-κB水平与非NRDS存在明显差异。而且在治疗后3 d升高，而后下降。可见，NRDS患者的Toll样受体对发病具有重要的作用。通过Logistic回归分析可知Toll样受体中的TLR2，TLR3，TLR4与NRDS呈负相关，NRDS越严重，Toll样受体中的TLR2、TLR3、TLR4就会降低，这也表明Toll样受体中的TLR2、TLR3、TLR4可以激活机体细胞的免疫功能，从而起到防御作用。

综上所述，对NRDS的Toll样受体分析可以更好的发现TLRs/JNK/ NF-κB/TNF-α信号通路与NRDS的相关性。

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The study of Toll-like receptors in the neonatal respiratory distress syndrome

XiongWei1,PuXiangyang2△,LiXiaowen3

(1.DepartmentofPaediatrics,People′sHospitalofYouyangCounty,Chongqing409800,China; 2.DepartmentofPaediatrics,CentralHospitalofQianjiangDistrict,Chongqing409000,China;3.DepartmentofNewPediatric,theAffiliatedChildren′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China)

Objective To study the toll-like receptors in neonatal respiratory distress syndrome (NRDS).Methods Forty two cases of neonatal respiratory distress syndrome were selected as cases group from October 2014 to October 2015,42 cases of neonatal respiratory distress syndrome in the same period were selected as the control group.The TLR2,TLR3 and TLR4 serology,TLRs/JNK/nf-kappa B/TNF alpha express signal path were analyzed;the corelation between TLR2,TLR3 and TLR4 serological levels and the incidence of NRDS was analyzed,and corelation between TNF-α,IL-6,JN,NF-κB and the incidence of NRDS was analyzed,too.Results The TNF-α,IL-6,JNK and nf-kappa B serological levels at 3rd and 7th day between two groups were significantly different compared with pre-treatment levels.And the TNF-α,IL-6,JNK and nf-kappa B serological levels between the case group and the control group were significantly different,too (P<0.05);the TLR2,TLR3 and TLR4 on the 3rd and 7th day after treatment were significantly lower than that of pretreatment,and the TLR2,TLR3 and TLR4 on the 3rd and 7th day after treatment of case group were significantly lower than that of control group (P<0.05);TNF -a,IL - 6,JNK and nf-kappa B serological levels and the NRDS incidence were closely related,and TLR2,TLR3 and TLR4 and the NRDS incidence were closely related,too.Conclusion The analysis of toll-like receptors in neonatal respiratory distress syndrome can help to find the correlation between TLRs/JNK/nf-kappa B/TNF alpha signaling pathways and the neonatal respiratory distress syndrome.

Toll-like receptors;respiratory distress syndrome,newborn;lung surface active substance;TLRs/JNK/NF-kappa B/TNF alpha signaling pathways

熊维(1969-)，副主任医师，本科，主要从事新生儿疾病研究。△

,E-mail:cqqjpxy@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.34.020

R722.6

A

1671-8348(2016)34-4814-03

2016-03-29

2016-05-13)