超声波辅助碱预处理蔗渣的研究

熊建华,余升强,朱红祥,王双飞

(1.广西大学环境学院， 广西南宁530004； 2.广西大学轻工与食品工程学院， 广西南宁530004；3.广西清洁化制浆造纸与污染控制重点实验室, 广西南宁530004)



超声波辅助碱预处理蔗渣的研究

熊建华,余升强1,朱红祥2,3,王双飞2,3

(1.广西大学环境学院， 广西南宁530004； 2.广西大学轻工与食品工程学院， 广西南宁530004；3.广西清洁化制浆造纸与污染控制重点实验室, 广西南宁530004)

摘要：为了提高蔗渣的酶解产糖率，利用超声波辅助碱预处理蔗渣。碱处理的单因素实验和超声波辅助碱的正交试验表明，超声波辅助碱预处理蔗渣最佳参数为：碱的最佳浓度为1%、最佳处理时间为60 min、最佳处理温度为80 ℃。在超声波辅助碱预处理蔗渣最佳条件下，酶解产糖率的单因素实验最佳条件为：酶解最佳时间为30 h，最佳酶用量为6.0 FPU，最佳酶解温度为50 ℃。超声波辅助NaOH预处理蔗渣是一种能有效降低预处理温度，提高酶解产糖量，提高物料的可及性，提升生产效率，降低纤维素转化为乙醇生产成本的预处理方法。

关键词：超声波；碱预处理；最佳参数；蔗渣

0引言

甘蔗渣属于非木材纤维，它是制糖工业的主要副产品，具有来源集中、产量巨大、收集简单、运输半径小等优点，是一种十分优质的可再生性农业废弃物资源。随着地球上不可再生资源煤、石油、天然气等日益消耗, 将天然木质纤维素如甘蔗渣等转化得到乙醇等可再生能源日益成为当前研究的热点，因此蔗渣的高效利用是一个重要的研究课题[1-3]。

蔗渣最主要的成分是纤维素，其次是木质素和半纤维素，其中纤维素占 32%～48%、木质素占 23%～32%、半纤维素占19%～24%、蛋白质约2%、灰分约4%，成分相对稳定，性质均一[4-6]。由于纤维素自身的结晶结构及木质素、半纤维素对它的保护作用，使反应试剂难以到达纤维素表面和扩散入纤维素内部，因此若要充分利用纤维素生物资源，就需要对其进行有效的预处理[7-9]。NaOH预处理对纤维物料的化学组成比例有很大影响，经过NaOH预处理过的植物纤维物料中的纤维素明显润胀，结晶度降低，纤维素内部受到破坏，所以NaOH 预处理是一种有效的植物纤维原料预处理方法，经 NaOH 预处理后的物料更易于酶解[10]。利用超声波的声空化作用，使纤维素表面和内部的结构受到损害，形态结构破碎，变得松散，使纤维表面积增加，提高植物纤维可接触性和反应活性，促进纤维水解产生更多的还原糖[11-14]。

目前有许多学者对蔗渣等生物能源的开发进行研究。覃益民等[15]用超声波辅助碱预处理蔗渣的研究，发现采用超声波辅助碱预处理的方法可以明显提高蔗渣酶解糖化活性。Chosdu等[16]研究表明，采用电子束照射辅助2%NaOH处理玉米秸秆等，酶解后葡萄糖得率提高13%。徐国涛[17]以玉米秸秆为原料，对其进行超声波辅助处理后纤维素酶水解的综合预处理，以提高玉米秸秆产气能力。但是大多数研究却没有探讨提高预处理能力的具体工艺参数，而有效的预处理是纤维素转化为燃料乙醇的关键，对提高物料的可及性，提高生产效率，降低生产成本具有重大的实际指导意义。本文为了提高蔗渣的酶解产糖率，在原有碱预处理蔗渣的研究基础上，引入超声波辅助碱预处理蔗渣的研究，通过单因素对碱处理蔗渣最优条件的研究，利用正交试验研究超声波辅助碱预处理蔗渣提高酶解产糖率的最优工艺条件，并使用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR-8400S)对预处理前后蔗渣内部结构的变化进行分析，旨在为纤维素乙醇生产工艺的预处理提供最优条件提供参考。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

1.1.1实验材料

实验中所用到的蔗渣是来自广西南宁糖厂。经过粉碎仪粉碎后过60目筛装袋备用。

1.1.2实验主要试剂

氢氧化钠；硫酸；丙酮；二水合氯化钡；碘化钾；酒石酸钾；3,5-二硝基水杨酸；苯酚；偏重亚硫酸钠；乙醇；重铬酸钾；苯。以上试剂均为国产分析纯级。

1.1.3实验仪器

分析天平(SL502)；紫外可见分光光度计(UV-2802S)；722分光光度计；恒温水浴振荡器(SHA-B)；恒温水浴锅(HH-S6)；超声波清洗仪(SK250LH)；离心机(TG16)；电炉；KSW-4D-11型马弗炉；烘箱；真空泵；傅里叶变换红外光谱仪(FTIR-8400S)。

1.2实验方法

1.2.1碱预处理单因素实验

1.2.1.1NaOH浓度

称取1 g蔗渣，与浓度为0%，0.25%，0.5%，1%，2%，3%的氢氧化钠溶液均匀混合,取固液比为40，置于100 ℃水浴锅中静置60 min。在离心机(4 000 r/min)中离心10 min，将碱预处理后的蔗渣于烘箱(80 ℃)中烘至恒重。取0.5 g预处理后的样品，加入0.01 g纤维素酶(2 000 FPU/g)和邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液(pH=4)，在温度为50 ℃下的恒温振荡水槽中酶解24 h。取样品上清液1 mL于25 mL比色管中，加入DNS试剂1 mL，置于100 ℃沸水浴中水浴5 min，冷却后用水补足到25 mL刻度，在540 nm波长下测定6个样品吸光度。

1.2.1.2处理时间

称取1 g蔗渣，与浓度为1%的氢氧化钠溶液均匀混合，置于40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴锅中静置60 min。其余步骤同1.2.1.1。

1.2.1.3处理温度

称取1 g蔗渣，与浓度为1%的氢氧化钠溶液均匀混合，置于100 ℃水浴锅中静置20、40、60、80、100 min。其余步骤同1.2.1.1。

1.2.2超声波辅助碱预处理蔗渣提高酶解产糖率工艺的正交试验

称取1 g蔗渣，选定超声波功率为100 W，频率为40 kHz，碱浓度(0.5%、1%、2%)、处理温度(80 ℃、90 ℃、100 ℃)、处理时间(30 min、60 min、90 min)，进行正交试验 L9(33)，编码表见表1。

表1　因素水平表

1.2.3超声波辅助碱处理蔗渣酶解单因素实验

1.2.3.1酶解时间

取1 g蔗渣在NaOH浓度为1%，温度为80 ℃，处理时间为60 min的条件下进行超声波处理，处理后的蔗渣离心并洗涤至中性，放于80 ℃烘箱中烘干至恒重，取0.5 g蔗渣加入一定量的纤维素酶水解48 h，并每隔一段时间(5 h)测定其产糖量。

1.2.3.2最适酶用量

称取6份0.5 g超声波辅助碱处理过的蔗渣，分别加入FPU为：1、2、4、6、8、10的纤维素酶，25 mL pH=4的磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液，放入50 ℃, 120 r/min恒温水浴振荡器中酶解30 h。

1.2.3.3最适酶解温度

称取6份0.5 g超声波辅助碱法预处理过的蔗渣，分别加入6.0 FPU的纤维素酶，一定量pH为4.0的磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液，放入温度分别为30，40，50，60，70，80 ℃，转速为120 r/min的恒温水浴振荡水器中酶解30 h。

1.3分析方法

1.3.1蔗渣主要成分的测定

甘蔗渣的纤维素、半纤维素、木质素的测定方法按文献[18]进行。

1.3.2还原糖的测定

还原糖量的测定采用 DNS(3,5-二硝基水杨酸)法[19]。

1.3.3甘蔗渣的红外分析

取少量未处理、碱处理、超声波处理后的蔗渣，分别与一定量的KBr粉末研磨混合均匀，压片法测定，测定范围为400～4 000 cm-1。

2结果与分析

2.1葡萄糖标准曲线的绘制

根据文献[19]提供的绘制标准曲线的方法绘制葡萄糖标准曲线，如图1。葡萄糖标准曲线中回归方程为y=0.5184x+0.0419，其中x为葡萄糖量(mg)，y为吸光度；线性相关系数为R2=0.999 5，在葡萄糖量为0.2～1.2 mg范围内成良好的线性关系。

2.2不同NaOH浓度对蔗渣水解产糖的影响

由图2可以看出， 1 g蔗渣经过不同浓度碱处理后，酶解产糖量变化较大，当碱浓度为从0%增加到0.5%时，酶解产糖量从0.675 mg增加到9.300 mg，当碱浓度增加到1%时，产糖率增加到15.550 mg。而碱浓度从l%增加到3%时，产糖量略有下降，且2%与3%浓度产糖量变化不大。从图2可很直观的发现，1%浓度的NaOH预处理的蔗渣产糖量最高，且为了节省实验药品用量，选择的碱浓度为1%。

图1葡萄糖标准曲线的绘制

Fig.1Protracting of glucose standard curve

图2NaOH浓度对蔗渣产糖量的影响

Fig.2The influence of NaOH concentration on sugar yield

2.3不同NaOH预处理时间对蔗渣水解产糖的影响

由图3可以看出，当处理时间低于60 min时，酶解产糖量随着预处理时间的增加而增加，当处理时间从60 min增加到100 min时，酶解产糖量基本没有变化，而且处理时间越长，能量的消耗越大。因此，综合这两方面原因，碱处理最适时间为60 min。

2.4不同NaOH预处理温度对蔗渣水解产糖的影响

由图4可以看出，随着温度的升高，酶解产糖量逐渐升高，这说明温度的高低是影响蔗渣的水解产糖效率的重要因素。另外，在图4中还发现，在预处理温度低于50 ℃时，温度对于蔗渣水解产糖的影响较低，当温度大于50 ℃时，随着温度的不断升高，蔗渣水解产糖量也明显升高。因此，高温有利于蔗渣水解产糖量的提高。

图3处理时间对蔗渣产糖影响

Fig.3The influence of time on the sugar yield

图4处理温度对酶解产糖量的影响

Fig.4The influence of temperature on the sugar yield

2.5最佳NaOH预处理后蔗渣组分测定及分析

预处理蔗渣的目的是破坏蔗渣半纤维素和木质素层，改变蔗渣的组成，破坏蔗渣中纤维素—半纤维素—木质素的链接，从而使得纤维素酶容易吸附进入，有利于酶解反应的进行。在探索出NaOH处理的各影响因素的最佳条件后，结合各最佳条件，对碱处理后的蔗渣进行组分分析，以考察碱处理法对蔗渣组成的影响,测定结果见表2。

表2　碱处理前后蔗渣组分

由表2可以看出，与未经过碱处理的蔗渣相比，碱处理后的蔗渣半纤维素含量从未处理前的35.9%降低至20.4%，木质素从19.7%降低至6.7%。结果表明，碱处理是针对半纤维素和木质素这两种主要成分的，纤维素含量的相对增加是由于半纤维素和木质素含量的减少所至。通过单一碱预处理蔗渣的单因素实验，由实验结果得出NaOH预处理蔗渣的单因素实验的最佳浓度为1%，最佳反应温度为100 ℃，最佳反应时间60 min。在得出单一NaOH预处理的最佳预处理条件后，可用于后续加入的超声波辅助碱的预处理环节中，同时也可用于探索单一碱预处理与超声波辅助碱预处理蔗渣酶解产糖量与对蔗渣组成的影响。

2.6超声波辅助碱预处理蔗渣提高酶解产糖量工艺的正交试验结果

由表3可知，极差越大对实验的影响就越大，通过R值，预处理因素的影响大小为：碱浓度A>预处理时间C>预处理温度B。结果表明最佳的预处理条件为A2B3C2。但从表3中可以看出，当预处理时间为60 min和90 min时，产糖量差别不大，从节省能源角度考虑，预处理时间选择60 min为最佳，碱浓度选择1%最佳，因而最终确定的优化方案为：A2B1C2，即碱浓度为1%、处理温度为80 ℃、处理时间为60 min。在最佳条件下预处理的蔗渣经过24 h酶解后，总产糖量为17.847 mg，比100 ℃时单一碱处理的产糖量15.525 mg还要高2.322 mg，产糖率提高了13%，且预处理温度降低了20 ℃。这一结果进一步说明，超声波辅助碱是一种有效的预处理方法，它能在降低了预处理温度的基础上，提高酶解糖化过程的糖化率，有着节约能源并最大化提高预处理的效果。

表3　L9(33)正交实验表

表4　正交实验结果分析1

1.K为方差，其代表对于因素的试验指标和；k=K/3；R为极差，根据R值大小可以判断因素主次顺序。

2.7超声波辅助碱酶解实验不同酶解时间的影响

由图5可以看出，在反应的初始阶段，酶解产糖量增加很快，而后逐渐趋于平缓，在30 h后曲线基本保持水平，说明蔗渣经过30 h的酶解，蔗渣中的纤维素水解量已达到最大，因此酶解的最佳时间为30 h。

2.8超声波辅助碱酶解实验不同酶用量的影响

由图6可以看出，在一定pH值、一定反应时间的条件下，还原糖产量随着酶浓度的增加先迅速提高而后变缓，这是因为酶浓度未达到最适浓度6.0 FPU时，还原糖产量随着酶浓度的增加而增加，而超过最适浓度6.0 FPU后，酶用量对于一定量的的蔗渣已经达到饱和，再增加酶用量酶解葡萄糖产量也基本不变。因此，最适酶用量为6.0 FPU。

图5超声波辅助碱预处理后蔗渣酶解进程曲线

Fig.5The course of enzymatic hydrolysis of ultrasonic-assisted alkali pretreated bagasse

图6最适酶用量的确定

Fig.6The determination of optimum dose of enzyme

图7　最适温度确定Fig.7　The determination of optimumtempeature

2.9超声波辅助碱酶解实验不同酶温度影响

由图7可以看出，纤维素酶酶解反应受温度的影响较大，当温度低于纤维素酶解反应的最适温度时，产糖率随着酶解反应温度的增加而提高，当温度超过50 ℃后，由于纤维素酶部分失活，使得酶解反应产糖率降低，当温度为70 ℃时，纤维素酶已基本没有活力。因此，可以看出酶解的最适温度为50 ℃左右。

2.10预处理前后红外图谱对比结构的改变

从图8可以看出，碱处理和超声波处理对蔗渣中纤维素结构的改变有一定的作用。碱处理在3 400 cm-1左右的吸收峰最弱，这表明氢键的结合力是最弱的。据有关文献表明[18]，在红外光谱中，波长为870～1 600 cm-1是一系列的共振峰，典型的纤维素吸收峰[19]位于波长在1 000～1 200 cm-1处，纤维素的C—O—C的不对称伸缩振动的吸收峰位于1 160 cm-1附近，纤维素和半纤维素的C—H振动吸收峰位于1 318 cm-1附近。数据显示，预处理后的样品特征吸收峰都有一定的变化，895 cm-1处半纤维素的特征峰也有改变。尤其是碱处理，木质素与半纤维素结合峰(1 510 cm-1)处明显减弱，有些甚至消失，这对于酶解产糖率提高影响很大。此外，木质素的基本结构位于1 200-1 800 cm-1处，这一谱带吸收峰有一定的改变，有些强吸收峰变弱甚至消失，特别是碱处理后，这一谱带的吸收峰变弱，这说明碱处理使木质素在预处理过程中很好地被去除了，从而减少了木质素对纤维素酶的抗性，提高了蔗渣酶解的产糖率。再来比较单一碱处理与超声波辅助碱处理的吸收光谱：在1 000～1 200 cm-1波长处的纤维素吸收峰，超声波处理的吸收峰弱于单一碱处理的吸收峰，这说明超声波处理后的蔗渣对其纤维素含量有所影响；在1 200～1 800 cm-1的木质素吸收峰处，超声波处理在此处吸收峰略弱于碱处理，这表明超声波处理有打破细胞壁结构使得木质素更好的释放的作用，从而提高酶解产糖率。

图8　预处理前后蔗渣的红外图谱

3讨论

超声波是频率高于20 kHz的一种弹性机械波，属于声波的一部分，它遵循声波传播的基本规律。用超声波处理蔗渣可以打断细胞壁的结构，有利于破坏蔗渣中纤维素、半纤维素和木质素的晶体结构，使得碱液更容易渗透到蔗渣结构中，提高糖产量。本文与张学金等[20]利用碱预处理蔗渣相比较，增加了超声波的辅助处理，碱浓度降低了9%，处理温度降低了10 ℃。可见通过引进超声波的处理，使得蔗渣结构被破坏，提高了氢氧化钠的利用率，降低了预处理的温度，节约了成本。

4结论

通过NaOH预处理蔗渣的单因素实验，得单一碱预处理蔗渣的单因素最佳实验条件为：最佳碱浓度为1%、最佳处理时间为60 min、最佳处理温度为100 ℃。对未处理和碱处理后的蔗渣进行组分的测定，得出与未经过碱处理的蔗渣相比，碱处理后的蔗渣半纤维素含量从未处理前的35.9%降低至20.4%，木质素从19.7%降低至6.7%。超声波辅助碱预处理蔗渣的正交试验表明，最佳预处理实验条件为：碱的最佳浓度为1%、最佳处理时间为60 min、最佳处理温度为80 ℃。对超声波辅助碱预处理蔗渣酶解的单因素实验，得出单因素最佳实验条件为：酶解最佳时间为30 h，最佳酶用量为6.0 FPU，最佳酶解温度为50 ℃。通过红外光谱分析未处理、碱处理、超波辅助碱处理的蔗渣结构，可以看出超声波辅助碱预处理蔗渣，对降低蔗渣木质素和半纤维素含量有着显著的效果。

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(责任编辑梁健)

收稿日期：2016-03-03；

修订日期：2016-03-25

基金项目：国家高技术研究发展计划(863)项目(2009AA06A416);广西青年自然科学基金项目(GXNSFBA053025)；广西桂科攻项目(14251009);清洁化制浆造纸与污染控制新技术及新理论创新研究团队项目(2013GXNSFFA019005)

通讯作者：王双飞(1963—)，男，湖南攸县人，广西大学教授,博士生导师；E-mail：wangsf@gxu.edu.cn。

doi:10.13624/j.cnki.issn.1001-7445.2016.0914

中图分类号：S566.1

文献标识码：A

文章编号：1001-7445(2016)03-0914-08

Study on ultrasound-assisted alkali pretreatment of bagasse

XIONG Jian-hua1, YU Sheng-qiang1, ZHU Hong-xiang2,3, WANG Shuang-fei2,3

(1.School of the Environment,Guangxi University, Nanning 530004, China;(2.Light Industry and Food Engineering College, Guangxi University, Nanning 530004, China；3.Guangxi Key Laboratory of Clean Pulp & Papermaking and Pollution Control，Guangxi University, Nanning 530004, China)

Abstract：In order to improve the rate of enzymatic hydrolysis of bagasse, ultrasound technology was used for assisting alkali to pretreat bagasse. Alkali treatment on single factor experiments and orthogonal bases ultrasonic-assisted alkali pretreatment bagasse experiments showed that the optimum parameters of ultrasonic-assisted alkali pretreatment bagasse were: alkali concentration was 1%, the processing time was 60 min, and the treatment temperature was 80 ℃. On optimal condition that ultrasonic-assisted alkali pretreatment bagasse experiments, the optimum parameters of enzymatic hydrolysis sugar yield on single factor experiments were: enzymolysis time was 30 h, enzyme dosage was 6.0 FPU, hydrolysis temperature was 50℃. The use of ultrasound-assisted alkali pretreatment bagasse was an effective pretreatment method that can reduce the pretreatment temperature, increase the enzymatic hydrolysis sugar yield, improve the accessibility of materials and the production efficiency, and reduce the cellulose into ethanol production cost.

Key words：ultrasonic; alkali pretreatment; optimum parameters; bagasse

引文格式：熊建华,余升强,朱红祥，等.超声波辅助碱预处理蔗渣的研究[J].广西大学学报(自然科学版)，2016，41(3)：914-921.