猪PR39真核表达载体构建

江学斌，陈嘉蔚，杨 军，胡位荣，肖安吉，卢志鹏，楚品品，张玲华



猪PR39真核表达载体构建

江学斌1，陈嘉蔚2，杨 军2，胡位荣1，肖安吉2，卢志鹏2，楚品品2，张玲华2

（1.广州大学生物工程研究所，广东 广州510006；2.华南农业大学生命科学学院/广东省农业生物蛋白质功能与调控重点实验室，广东 广州510642）

摘 要：为构建猪源抗菌肽PR39的高效表达真核载体pVAX1-PR39，通过猪股骨骨髓组织基因组RNA合成cDNA，根据PR39基因全长序列，设计高效表达启动子，利用PCR扩增获得PR39全长基因，连接到真核载体pVAX1，构建重组载体pVAX1-PR39。转化大肠杆菌DH5α后进行菌落PCR鉴定和测序，测序结果与NCBI网站上猪源抗菌肽PR39基因序列完全一致，表明已成功构建了猪PR39的真核表达载体，理论上所构建的PR39表达载体能够提高猪的免疫能力。

关键词：抗菌肽；PR39；真核表达；载体；pVAX1

抗菌肽广泛存在于自然界，是生物体内存在的一种具有抗菌活性的小分子蛋白，氨基酸数目小于100，常带正电荷，是生物体免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽活性物质［1］，是生物体先天免疫的重要组分，对革兰阳性菌、革兰阴性菌均有抑杀作用［2］。勒步尚等［3］发现抗菌肽或类似抗菌肽的小分子肽类广泛存在于生物界，包括细菌、动植物和人类。猪源抗菌肽是从猪体内分离出来的一种抗菌肽。目前已经从猪体内发现了12 种以上抗菌肽，这些抗菌肽具有不同的螺旋结构，分子量相对较小，小于10 ku［4］。抗菌肽PR39是其中一类由39个氨基酸残基构成的多肽，属于Cathlin家族［5］，是众多抗菌肽中的一种富含精氨酸的抗菌肽，由猪的小肠上皮细胞分泌［6］。作为一种肽类抗生素，抗菌肽PR39具有广谱高效的抗菌作用，而且不易诱导细菌耐药，因此在细菌感染的治疗中PR39具有多方面优势，有望成为治疗胞内菌感染的新一代抗菌药物。

已有研究表明，把抗菌肽作为饲料添加剂对猪的免疫能力有较大的提高［7］。因此，本研究针对仔猪构建真核表达载体，根据PR39基因全长序列设计高效表达核酸序列，将猪源PR39基因连接到载体pVAX1上。表达载体可以作为免疫佐剂与其他疫苗共同作用，从而达到增强仔猪免疫能力的目的。

1　材料与方法

1.1 试验材料

大肠杆菌DH5α，真核细胞表达载体pVAX1质粒均由广东省农业生物蛋白质功能与调控重点实验室保存。Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、T4 DNA连接酶、EcoRⅠ、NheⅠ、D2000 DNA marker购自日本Takara公司；逆转录试剂盒购自日本TOYOBO公司；Goldview、高保真pfu酶购自北京鼎国生物技术有限公司，PCR扩增试剂盒、凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、引物（表1）购自上海生工生物公司；其他常用试剂均为进口或国产分析纯。

表1 引物序列

1.2 试验方法

1.2.1 cDNA合成 利用Trizol法提取猪股骨骨髓组织基因组RNA，选择 OD260/OD280＞1.8且完整性好的RNA样品为模板。根据从NCBI网站上查出的猪PR39基因序列，用引物设计软件Priemr 5.0设计2条引物PR39-F1、PR39-R2（表1）。RNA逆转录反应体系：5×RTBuffer 2 μL、RT Enzyme Mix 0.5 μL、Primer Mix 0.5 μL、RNA 1 μg，ddH2O补足10 μL。PCR反应程序：37℃15 min，98℃5 min。逆转录所得的cDNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，-80℃保存。

1.2.2 带酶切位点PR39基因的扩增 根据PR39基因全长序列设计特异引物，考虑到翻译起始需要依赖于mRNA 5′端帽子结构，应把PR39序列插至CPG序列前面。为了能使PR39基因在真核细胞中高效表达，本试验在真核载体pVAX1启动子前添加Kozak序列，在插入pVAX1的PR39基因全长序列的引物PR39-F2和PR39-R2（表1）上分别加入Nhe I和 EcoR I酶切位点和保护碱基。

取上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系：10×PCR Buffer 5 μL、dNTP Mix（10 mmol/L）1μL、PR39-F2 （10 μmol/L） 1 μL、PR39-R2 （10μmol/L） 1 μL、PR39 1 μL、pfuDNA聚合酶（5 U/mL） 0.5 μL，ddH2O补足50 μL。PCR反应程序：94℃ 3 min；94℃ 50 s、58℃ 30 s、72℃1min，30个循环；72℃ 10 min。反应完毕后，用1%琼脂糖电泳检测PCR结果。

1.2.3 pVAX1-PR39重组载体的构建与鉴定 对载体pVAX1和PR39基因进行双酶切，回收酶切片段后在16℃下T4连接酶作用16 h。取上述连接产物转化DH5α感受态细胞，于含0.1 mg/mL Amp 的LB平板上37℃倒置培养16 h。挑取透明圆润、较大的连接产物转化子单菌落进行菌落PCR鉴定。配制菌落PCR体系：10×PCR Buffer 2 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.4 μL，dNTPs （10 mmol/L） 0.5 μL，引物T7 （10 μmol/L） 0.5 μL，PR39-R2 （10 μmol/L） 0.5 μL，Taq酶（5 U/μL） 0.5 μL，菌落裂解物5 μL，ddH2O 补足至20 μL。PCR反应程序：94℃5 min；94℃50 s、58℃45 s、72℃1min，30个循环；72℃5 min。将阳性菌株委托上海生工进行序列测定，最终获得含有目的片段的重组载体pVAX1-PR39。

2 结果与分析

2.1 猪PR39基因克隆的检测结果

采用引物PR39-F1和PR39-R1，以逆转录所得cDNA为模板，PCR扩增所得猪抗菌肽PR39基因应为535 bp，经琼脂糖凝胶电泳检测，得到与预期大小一致的目的条带（图1）。

M：DNA marker；1：PR39基因PCR产物图1 猪PR39基因PCR产物的电泳结果

2.2 带酶切位点PR39基因的检测结果

采用特异引物PR39-F2和PR39-R2，PCR扩增得到带有Nhe I 和EcoR I酶切位点的PR39全长基因应为539 bp，经琼脂糖凝胶电泳检测，与预期结果基本相符（图2）。

M：DNA Marker；1：带酶切位点PR39基因的PCR产物图2 带酶切位点PR39基因的PCR产物电泳结果

2.3 pVAX1-PR39重组子的鉴定结果

挑取菌落进行双酶切，采用通用上游引物T7和下游引物PR39-R2进行 PCR扩增，筛选阳性克隆进行琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果600 bp处有明显条带，与目的片段大小相符（图3），因此可以初步判定pVAX1载体已成功连接上PR39。而将重组子委托上海生工序列测定，测序结果与NCBI网站上猪的抗菌肽PR39的基因序列完全一致，因此判定pVAX1载体已成功连接上PR39。

M：DNA marker；1：pVAX1的PCR产物；2：pVAX1-PR39重组子PCR产物；3：pVAX1-PR39重组子双酶切图3 PCR及酶切鉴定重组质粒pVAX1-PR39

3　结论与讨论

近年来，养殖业药物残留和细菌耐药性等问题日渐严重，给人类的健康带来潜在威胁［8］，引发了人们对食品安全的关注，因此寻找抗生素替代品已迫在眉睫。抗菌肽具有分子量小、热稳定、水溶性好、抗菌谱广等特征，更重要的是，抗菌肽仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞［9］。目前，抗菌肽作为传统抗生素的替代物因其自身特征而受到人们的关注，具有广阔的应用前景。抗菌肽除了可以直接杀灭入侵体内的病原微生物外，还可以在宿主免疫反应的不同阶段表现出免疫增强作用［10］，其作用机制与抗生素通过阻断大分子生物合成的作用机理完全不同，很难出现耐药菌株［11］。

目前研究已发现PR39对常见病原微生物具有广谱抗菌活性，也具有趋化、抑制炎症、促进损伤修复等免疫功能［12］。刘阳欣等［13］将PR39全基因定向插入到表达载体 pCold质粒，并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导获得有抗菌活性重组PR39抗菌肽。明飞平等［14］根据毕赤酵母密码子偏爱性，人工合成4条引物通过重叠获得PR39基因，插入酵母表达载体pPIC9K，敲除部分多余核苷酸得到pPIC9K-PR39-D-E，转化到毕赤酵母SMD1168实现高效表达。刘涛等［15］构建PR-39重组腺病毒表达质粒，并在小鼠胚胎间充质干细胞 C3H10T1/2中高效表达。

本研究选择以猪源抗菌肽PR39基因连接到载体pVAX1构建重组载体，结果表明，猪PR39真核表达载体成功构建，理论上所构建的PR39表达载体能够提高猪的免疫能力。但其实际功效、能否真正提高猪免疫能力还需要进一步检验。

参考文献：

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（责任编辑 崔建勋）

中图分类号：S813.3；S828

文献标识码：A

文章编号：1004-874X（2016）03-

收稿日期：2015-10-12

基金项目：广州市属高校科技计划项目（12014 20755）

作者简介：江学斌（1969-），男，博士，讲师，E-mail：jxbcalvin@126.com

通讯作者：张玲华（1973-），女，博士，教授，E-mail：lhzhang@scau.edu.cn

Construction of eukaryotic expression vector of porcine PR39

JIANG Xue-bin1，CHEN Jia-wei2，YANG Jun2，HU Wei-rong1，XIAO An-ji2，LU Zhi-peng2，CHU Pin-pin2，ZHANG Ling-hua2
（1.Research Institute of Bioengineering，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China；2.College of Life Sciences，South China Agricultural University/ Key Laboratory of Agricultural Biological Protein Function and Regulation of Guangdong Province，Guangzhou 510642，China）

Abstract：To construct the eukaryotic expression vector of porcine antimicrobial peptide PR39，cDNA was synthesized by the RNA from bone marrow of porcine femur. According to the full length sequence of PR39 gene，a efficient expression gene sequence was designed，and the full length gene of PR39 was amplified by PCR and connected to the eukaryotic vector pVAX1，then the recombinant vector pVAX1-PR39 was constructed and transferred into E. coli DH5α followed by colony PCR identification and sequencing. The results showed that the sequences were completely consistent with the PR39 gene sequences published on NCBI. The PR39 eukaryotic expression vector was constructed and PR39 expression vector was capable of improving the immune ability of pig in theory.

Key words：antimicrobial peptide；PR39；eukaryotic expression；vector；pVAX1