时间分辨荧光技术及酶联免疫吸附试验检测乙型肝炎两对半指标的比对分析

江培涛,杨　健,杨正南

(南京鼓楼医院集团仪征医院检验科,江苏扬州 211900)



·临床研究·

时间分辨荧光技术及酶联免疫吸附试验检测乙型肝炎两对半指标的比对分析

江培涛,杨健,杨正南

(南京鼓楼医院集团仪征医院检验科,江苏扬州 211900)

摘要:目的通过比对时间分辨荧光技术(TRFIA)及酶联免疫吸附试验(ELISA)对血清标本中乙型肝炎两对半指标的检测结果，验证这两种方法是否具有等效性。方法分别用TRFIA及ELISA检测160份临床标本的两对半指标，记录检验结果并对检验结果进行统计学分析。结果经过配对资料χ2检验分析，两种方法测定乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗体(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗体(HBeAb)、乙型肝炎核心抗体(HBcAb)时结果差异有统计学意义(P<0.05)。结论两种检测方法均可用于临床乙型肝炎两对半指标的检测，但TRFIA优于ELISA的灵敏度和特异度。

关键词:时间分辨荧光技术；酶联免疫吸附试验；乙型肝炎两对半

乙型肝炎两对半是目前国内医院最常用的乙型肝炎病毒(HBV)感染检测血清标志物，两对半检查项目包括：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗体(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗体(HBeAb)、乙型肝炎核心抗体(HBcAb)。因为核心抗原的检测方法较复杂，临床上通常不做，所以在“乙型肝炎五项”检查中，前四项是两对，核心抗体是半对，因此被称为乙型肝炎两对半。两对半的检测对于乙型肝炎患者的诊断和治疗以及健康人群病毒携带的筛查和预防免疫接种都具有重要意义。目前，用于检测乙型肝炎两对半的方法主要是酶联免疫吸附试验(ELISA)，该方法具有灵敏度高、特异度强、操作简便等特点，但该法主要用于定性检测[1]。随着免疫分析技术的不断进步以及临床对实验室要求的不断提高，荧光免疫自动化分析技术已被逐渐应用于临床，时间分辨荧光免疫技术(TRFIA)就是以抗原抗体反应与荧光物质发光和时间分辨技术相结合的近代荧光广谱技术。由于该方法具有灵敏度高、特异度好、检测范围宽、环境污染小等特点，是目前最具有发展前途的超微量分析技术，其检测下限可达5×10-14mol/L[2]，能用于临床定量检测乙型肝炎两对半指标。本研究通过比较TRFIA及ELISA的检测结果，评价时间分辨荧光技术用于乙型肝炎两对半检测的价值。

1资料与方法

1.1一般资料收集本院2013年1月至2014年12月门诊及住院乙型肝炎患者和健康体检者共160例血清，其中健康体检人员46例。标本无脂血、黄疸、溶血。

1.2仪器与试剂ANYTEST时间分辨荧光免疫分析仪、EFFICUTA全自动标本前处理系统及相关定量检测试剂盒由苏州新波生物技术有限公司生产；PW-960Plus全自动酶标洗板机由深圳汇松科技发展有限公司生产；乙型肝炎两对半ELISA检测试剂盒由上海科华生物工程股份有限公司生产；BIO-RAD Model680酶标仪由美国伯乐公司生产。

1.3方法

1.3.1TRFIA检测两对半指标准备好洗涤液及铕标记物等试剂并将试剂与相应数量的微孔反应条置室温中平衡；吸取100 μL样品及校准品按相应顺序加入微孔反应条中；室温条件下震荡孵育40 min；孵育结束后每孔注入洗涤液400 μL，重复洗涤4次；每孔加入100 μL铕标记物，室温条件下震荡孵育40 min；结束后同上重复洗涤6次；每孔中加入增强液100 μL，室温条件下震荡孵育5 min；上述步骤均由EFFICUTA全自动标本前处理系统自动完成。之后将微孔反应板条插入ANYTEST时间分辨荧光分析仪进行检测分析。

1.3.2ELISA检测两对半指标准备好洗涤液及相应数量的微孔反应板条，核心抗体的检测标本用生理盐水作1∶30稀释；加入50 μL待测标本和阴、阳性对照于反应微孔中，预留空白对照；在待测标本及阴阳性对照孔中加入酶结合物50 μL;将反应板条用封板纸覆盖并在振荡器上震荡混匀10 s后置37 ℃孵育30 min；取出反应板撕去封板纸，洗涤反应板5次；洗涤结束后每孔加入显色剂A液、显色剂B液各50 μL，充分混匀，封板后置37 ℃孵育15 min；每孔加入终止液50 μL，混匀；用酶标仪读数，取波长450 nm，先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。

1.3.3两种方法的线性范围及最低检测浓度的比较将1例HBsAg强阳性血清进行倍比稀释后分别用两种方法检测并记录结果。

1.4统计学处理采用SPSS19.0统计软件进行数据处理及统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1TRFIA及ELISA检测结果采用TRFIA及ELISA检测160份标本乙型肝炎两对半指标，见表1。TRFIA和ELISA对160份标本中HBsAg的阳性检出率分别为58.75%和56.88%，对HBsAb的阳性检出率为52.50%和46.25%，对HBeAg的阳性检出率为35.00%和30.00%，对HBeAb的阳性检出率为46.88%和43.75%，对HBcAb的阳性检出率为70.00%和63.13%，两种方法的结果差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2两种方法检测HBsAg的线性范围及最低浓度将1份HBsAg强阳性血清进行倍比稀释后分别用两种方法检测HBsAg的线性范围及检测最低浓度，见表2。

表1　TRFIA及ELISA检测结果(n)

表2　两种方法检测HBsAg的线性范围及最低浓度

3讨论

有资料表明，我国大约有0.93亿HBV携带者[3]，乙型肝炎血清抗原抗体检测是临床诊断HBV感染及判断预后的传统指标。(1)HBsAg主要在感染HBV后1～2个月在血清中出现，阳性常见于乙型肝炎潜伏期和急性期，慢性迁延性肝炎、活动性肝炎、肝硬化、肝癌及慢性HBsAg携带者。(2)HBsAb是针对HBsAg产生的中和抗体，表明机体具有一定的免疫力，一般在HBsAg转阴后出现，是疾病恢复的开始，阳性提示机体曾感染过HBV或接种过乙型肝炎疫苗，可持续多年，其滴度与特异性保护作用相平行。(3)HBeAg阳性表明患有乙型肝炎，是病毒复制活跃传染性强的标志，常在HBsAg阳性的血清中检出，其持续阳性者易转变为慢性肝炎。(4)HBeAb出现于急性感染的恢复期，阳性多见于HBeAg转阴的患者，意味着HBV被部分清除，传染性减低，部分慢性肝炎，肝硬化，肝癌患者可持续阳性。(5)HBcAb是反映肝细胞受到HBV侵害的一种指标，抗HBc-IgG在机体感染HBV后1个月左右开始升高，高滴度的抗HBc-IgG表明患有乙型肝炎[4-6]。

本研究表1结果显示，TRFIA和LEISA对乙型肝炎两对半指标的检测结果差异有统计学意义(P<0.05)。本研究表2结果显示，TRFIA对HBsAg的最低检出浓度为0.13 ng/mL，与国内报道一致[7]。而ELISA则为0.49 ng/mL。这表明ELISA对低浓度的标本存在假阴性的问题，这是由于ELISA双抗体夹心法检测小分子半抗原的过程中，若待测抗原浓度过高则易产生钩状效应[1]，使最终测定结果低于实际浓度。另有文献[8]报道,低浓度的HBsAg可能与S基因的变异和自身免疫状况有关。临床实验室在遇到超过检测下限的可疑标本时，应进一步用其他方法测定。

TRFIA是以抗原抗体反应与镧系元素螯合物被激发后产生特异荧光相结合的近代荧光技术，具有高特异度，高敏感度，不污染环境等优点 。ELISA方法中，HBeAb和HBcAb采用竞争一步法测定，其方法上的局限性和人为因素的干扰相对较多，而TRFIA方法操作自动化，避免了孵育时间、温度及手工加样等因素的干扰，因而测定结果相对更为客观、准确[9]。但由于铕标记物易受环境中粉尘污染而造成假阳性的可能，因而也需要进一步完善和优化。

参考文献

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.059

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)13-1877-03

(收稿日期：2016-03-15修回日期：2016-04-18)