甘露糖结合凝集素水平的调节与肺结核易感性关系的研究*

刘　洋,郭艳玲,姜广路,孙　琦,郑素华,张宗德△

(北京市结核病胸部肿瘤研究所/首都医科大学附属北京胸科医院：1.流行病学研究室；2.检验科；3.参比室；4.分子生物学实验室　101149)



·论著·

甘露糖结合凝集素水平的调节与肺结核易感性关系的研究*

刘洋1,郭艳玲2#,姜广路3,孙琦4,郑素华1,张宗德4△

(北京市结核病胸部肿瘤研究所/首都医科大学附属北京胸科医院：1.流行病学研究室；2.检验科；3.参比室；4.分子生物学实验室101149)

摘要:目的研究甘露糖结合凝集素(MBL)水平的调节与肺结核易感性的关系。方法对142例肺结核患者和120例健康对照者血清中MBL水平进行测定。同时采用限制性片段长度多态性分析方法对MBL2基因多态性进行测定。结果采用单因素方差分析不同基因型组的MBL水平，YA/YA组，XA/YA组和XA/XA、YA/YB、 XA/YB、YB/YB组，发现3组之间和任何两组之间的MBL 水平差异均有统计学意义(P<0.01)。肺结核患者MBL水平显著高于健康对照(P<0.01)。健康对照者中携带YA/YA基因的个体中有93.2%(55/59)的MBL水平大于1 000 ng/mL。而携带XA/XA或B等位基因的个体100%(26/26) 的MBL水平小于或等于1 000 ng/mL。结论MBL水平可能与肺结核易感性有关，而决定高水平MBL的YA/YA 基因可能是一种保护性基因。

关键词:甘露糖结合凝集素;多态性；结核；易感性

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种感染性疾病，每年大约有两百万人因感染结核而死亡。由于多耐药及超级耐药菌的出现导致结核病疫情不断加剧[1]。在结核病发生过程中，结核分枝杆菌与环境、宿主间复杂的相互作用可能起到关键的影响。而某种程度上宿主因素可能决定结核易感性[2]。甘露糖结合凝集素(MBL) 是一种Ca2+依赖型凝集素家族中的急性期蛋白，为天然免疫系统中一个关键因子。它能通过碳水化合物识别区识别病原微生物[3-4]。MBL 由MBL2编码，后者位于第10号染色体上，有7个MBL2 单核苷酸多态性(SNPs) 可能与MBL水平或功能相关 。在外显子1区有3个单核苷酸改变将野生型变为突变型(A/B，A/C和A/D)，这些改变打破胶原结构从而形成功能性寡聚物。此外位于启动子和5′-非翻译区的其他等位基因如H/L、X/Y、P/Q,也可被SNPs鉴定，其中等位基因X表现出更低的转录活性[5]。

MBL 基因多态性与结核易感性的关系有过相关报道，但MBL 基因多态性与MBL水平关系以及MBL水平与结核关系报道较少。一些研究者发现低水平的血清MBL能抑制结核菌感染[6-7]，而另一些研究则有相反的观点[8-9]。本文通过MBL2基因多态性与MBL水平关系及肺结核患者与健康对照者MBL水平比较，探讨MBL水平与肺结核易感性关系。

1资料与方法

1.1一般资料选取2010年1月至2012年6月首都医科大学附属北京胸科医院收治入院的肺结核患者142例，患者诊断标准参照中华医学会结核病临床诊疗指南，除肿瘤、肺炎、糖尿病等疾病。另选取本院同期健康体检者120例作为健康对照，排除既往有肺结核病史者。本研究经北京市胸科医院伦理委员会批准，所有纳入研究者均签署知情同意书。

1.2标本收集与DNA提取抽取患者和健康对照者静脉血4 mL，3 000×g离心分离血清。同时抽取患者和健康对照者静脉血2 mL经乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。采用血液DNA抽提试剂盒(MBI公司，美国)进行DNA提取。具体操作按照说明书进行。将提取的DNA储存在-20 ℃冻存。

1.3MBL2-221X/Y and 外显子154A/B基因分型对-221位点和外显子区54号位点限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)进行基因分型。引物序列为(1)5′-ACC TGG GTT TCC ACT CAT TCT CAT-3′，(2)5′-CCC CAG GCA GTT TCC TCT GGA AGG-3′,扩增产物为623 bp。反应体系为50 μL，PCR反应条件为：95 ℃ 4 min；之后95 ℃ 30 s，63 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR扩增产物经柱式纯化试剂盒(MBI公司,美国)纯化后分别采用BtgⅠ(NEB公司,美国)和BshNⅠ(MBI公司,美国)进行酶切消化，酶切体系为20 μL，37 ℃过夜消化。BtgⅠ针对X/Y基因型(Y 等位基因为540 bp)，BshNⅠ(A等位基因为536 bp)。扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳分离。根据PCR产物条带数及位置确定基因型。

1.4血清MBL水平测定采用人MBL ELISA Kit (R&D,美国)对142例肺结核患者和120例健康对照者的血清MBL水平进行测定。具体操作按照说明书进行。同时对MBL2基因多态性与MBL水平关系及肺结核患者和健康对照者之间血清MBL水平进行分析比较。

1.5验证MBL2基因多态性和MBL水平的关系将MBL2二倍体型分为3组，分别为YA/YA组，XA/YA组和XA/XA、YA/YB、XA/YB、YB/YB组，比较组间MBL水平差异。

1.6统计学处理采用SPSS17.0进行统计分析。采用单因素方差分析，对不同MBL2基因型与MBL水平之间差异进行比较。采用t检验对肺结核患者与健康对照者的MBL水平进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1肺结核患者和健康对照者的MBL水平比较肺结核患者MBL水平为(2 291.6±1 575.9)ng/mL，健康对照者为(1 721.1±1 423.3)ng/mL，二者差异有统计学意义(P<0.01)，肺结核患者血清中MBL水平更高。肺结核患者MBL基因 YA/YA二倍体型有49例，频率为34.5%，健康对照者YA/YA二倍体型为59例，频率为49.2%，二者差异有统计学意义(P=0.016) ，而MBL2基因XA/XA二倍体型则在肺结核患者中相对更多有15例(10.6%)，健康对照者为2例(1.7%)，二者差异有统计学意义(P=0.004)。见表1。

表1　不同二倍体型在肺结核患者与健康对照者之间的比较[n(%)]

2.2MBL2基因多态性和MBL水平的关系YA/YA组，XA/YA组和XA/XA、YA/YB、XA/YB、YB/YB组之间MBL 水平差异有统计学意义(P<0.01)，此外任何两组之间也差异有统计学意义(P<0.01),见表2。在健康对照者中携带YA/YA基因的个体中有93.2% (55/59) 的MBL水平大于1 000 ng/mL。而携带XA/XA或B等位基因的个体100% (26/26) 的MBL水平小于或等于1 000 ng/mL。

表2　不同二倍体型在肺结核患者和健康对照者中的MBL水平

3讨论

由于MBL基因启动子区与外显子各位点存在连锁不平衡。到目前为止，仅证实了LYPA、LYPB、HYPA、HYPD、LXPA、LYQA、LYQC共7种单体型[10]。本研究中，针对MBL2 基因-221Y/X和外显子l 密码子54 A/B进行分析发现，研究人群中仅有YA、XA、YB 3种单倍体型。基因型YA/YA在健康对照者中频率更高。说明YA/YA或许是一种保护性基因型而XA/XA则有可能是一种结核病易感基因型。这一结果与文献[10-11]研究结果一致。但有研究认为X、Y等位基因与肺结核发生无关[12]。考虑到结核分枝杆菌与人类相互作用的进化史,许多基因突变发生频率较高，有研究者指出不同生活环境选择压力可能使MBL基因型发生突变并对结核感染产生强烈的表型影响[12]。所有这些研究表明结核感染的发生是一个复杂的过程。

MBL由肝脏分泌，是一种钙依赖因子，同时具有胶原区及凝集素域为特征的胶凝集素家族的成员，可与广泛表达于病原菌的糖类结合(特别是甘露糖和N-乙烯葡萄糖残基)。MBL在宿主防御病原微生物中起到重要作用。这些病原微生物包括细菌、真菌、寄生虫和病毒[13-16]。通过与结核分枝杆菌结合，MBL起到调理素作用,增强吞噬作用，并促进炎性反应以释放细胞因子。因此，有研究者认为高水平血清MBL可能通过促进对结核分枝杆菌调理作用导致结核感染概率增加。此外，MBL 可能增强对其他分枝杆菌吞噬活性，并引起MBL缺乏从而对诸如麻风分枝杆菌感染起到保护性防御作用[17]。这与本研究结果一致。同时为证实MBL 基因与与血清MBL水平关系，本研究对肺结核患者和健康对照者中不同基因型的MBL水平进行比较，发现MBL在不同二倍体型之间差异有统计学意义(P<0.01)，不同组中两两比较仍有显著性差异。虽然还不能定义MBL缺乏的标准，但有研究通过对大样本(n=1 037)进行分析后将MBL水平≤1 000 ng/mL 作为部分和严重的MBL缺乏[18]。本研究结果几乎与这一研究一致。在健康人群中携带YA/YA 基因的个体中有55/59 (93.2%)的MBL水平大于1 000 ng/mL，在XA/XA或B-携带个体中达到100%(26/26)。

有研究者对涉及MBL2 基因型和/或MBL 水平与结核病关系的17 个实验进行meta分析后发现，血清MBL水平在结核感染时均升高。这或许表明高水平MBL与结核病易感性显著相关。本研究结果与这些研究一致。近年来，有研究对结核病患者中非吸烟人群进行研究发现，被动吸烟，烹调采用固体燃料，以及MBL基因多态性均与结核易感性有关。说明结核病发生涉及环境、遗传、宿主内环境等多因素，还需要对相关机制进行进一步的探讨。

总之,本研究表明高水平MBL或许与结核病易感性显著相关。启动子-221 (Y/X) 和外显子l密码子54 (A/B) MBL 基因突变与肺结核易感性有关。而YA/YA可能对肺结核病发生起到保护作用。尽管环境、遗传、宿主内环境等多种因素涉及结核病产生，通过结核病MBL水平测定以及MBL基因多态性与MBL水平相互关系与结核易感性的研究，将有助于了解结核病的发生机制，为结核病的控制提供思路。

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*基金项目:北京市科技新星基金项目(2008A040);北京市优秀人才培养项目(2012D003034000006)。

作者简介：刘洋，男，副研究员，主要从事结核分子生物学和流行病学研究。 △通讯作者，E-mail:zzd417@163.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.008

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)13-1767-03

(收稿日期：2016-02-12修回日期：2016-04-24)

Study on relation between regulation of MBL level and pulmonary tuberculosis susceptibility*

LIUYang1,GUOYanling2,JIANGGuanglu3,SUNQi4,ZHENGSuhua1,ZHANGZongde4△

(1.BeijingMunicipalInstituteofTuberculosisandChestTumor/ResearchRoomofEpidemiology;2.DepartmentofClinicalLaboratory;3.ReferenceRoom;4.ExperimentRoomofMolecularBiology,AffiliatedBeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China)

Abstract:ObjectiveTo study the relation between the regulation of mannose-binding lectin (MBL) level and pulmonary tuberculosis(TB) susceptibility.MethodsA total of 142 inpatients with pulmonary TB and 120 healthy controls were recruited to participate in this case-control study.Serum MBL level was detected,meanwhile the restriction fragment length polymorphism(RFLP) was adopted to detect MBL2 gene polymorphism.ResultsThe one-way analysis of variance was adopted to analyze the MBL level in different genotype groups,including the group YA/YA,XA/YA,XA/XA,YA/YB,XA/YB and YB/YB,it was found that the MBL level had statistical differences among 3 groups and between any two groups(P<0.01).The MBL level in the pulmonary TB group was significantly higher than that in the healthy control group(P<0.01).Among the healthy controls,the MBL level in 93.2% individuals(55/59) carrying YA/YA genotype was>1 000 ng/mL,while which in 100% individuals(26/26) carrying genotype XA/XA or allele B was≤1 000 ng/mL.ConclusionThe MBL level may be associated with the susceptibility to pulmonary TB.The YA/YA gene for determining high MBL level may be a protected gene.

Key words:mannose binding lectin;polymorphism;tuberculosis;susceptibility

#共同第一作者：郭艳玲，女，副研究员，主要从事临床微生物鉴定和分子生物学研究。