甘露糖受体介导的人参多糖注射液对肝癌细胞增殖抑制

郭林娜，高恒宇，何苗，刘丹.齐齐哈尔医学院解剖教研室，黑龙江齐齐哈尔　6006；.大庆市油田总院病理科，黑龙江大庆　6000；.齐齐哈尔医学院生物遗传教研室，黑龙江齐齐哈尔　6006



甘露糖受体介导的人参多糖注射液对肝癌细胞增殖抑制

郭林娜1，高恒宇1，何苗2，刘丹3
1.齐齐哈尔医学院解剖教研室，黑龙江齐齐哈尔161006；2.大庆市油田总院病理科，黑龙江大庆163000；3.齐齐哈尔医学院生物遗传教研室，黑龙江齐齐哈尔161006

［摘要］目的探讨人参多糖注射液对人肝癌细胞BEL-7402和HpeG2增殖抑制的机制及与甘露糖受体表达水平的关系。方法实验于2014年6月在齐齐哈尔医学院中心研究室进行，利用荧光免疫法检查甘露糖受体在人肝癌细胞BEL-7402和HpeG2上的表达水平；采用CCK8检测细胞的增殖抑制情况。 结果免疫荧光结果：甘露糖受体在人肝癌细胞HpeG2上表达分布较少，而在人肝癌细胞BEL-7402上表达分布较多；CCK8结果：在一定浓度范围内，人参多糖注射液对人肝癌细胞BEL-7402和HpeG2的增殖有明显抑制作用（P＜0.05），并且与浓度和时间呈正相关，同时证明人参多糖注射液对人肝癌细胞BEL-7402的增殖抑制作用明显高于对HpeG2增殖抑制作用 （P＜0.05）。 结论人参多糖注射液对人肝癌细胞BEL-7402和HpeG2的增殖有明显的抑制作用；对人肝癌细胞BEL-7402的增殖抑制作用高于对HpeG2的抑制作用，增殖抑制作用的高低与甘露糖受体表达水平呈正相关。

［关键词］肝细胞癌；人参多糖注射液；甘露糖受体；凋亡

人参多糖（ginseng polysaccharide，GPS）是人参的主要成份之一，如抗肿瘤、抗疲累、抗辐射、降血糖等作用［1-2］。甘露糖受体作为一种多糖受体已经被学者证实［3-4］。本研究检测人肝癌细胞BEL-7402和HpeG2上甘露糖受体的表达水平，同时检查人参多糖注射液对人肝癌细胞BEL-7402和HpeG2的增殖抑制作用，观察甘露糖受体的表达水平与人参多糖注射液对两个细胞系增殖抑制率之间的关系，进而探讨人参多糖注射液对人肝癌细胞BEL-7402和HpeG2增殖抑制的机制。本实验于2014年6月在齐齐哈尔医学院中心研究室开始，2015年11月结束。

1　材料

1.1药物与试剂

人参多糖注射液购于山西普德药业股份有限公司，CD206人抗兔单克隆抗体购自Proteintech公司，CCK8试剂购于北京同仁公司，二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，其余为进口或国产分析纯。

1.2细胞株

人肝癌细胞HpeG2由哈尔滨医科大学第一附属医院馈赠，人肝癌细胞BEL-7402由齐齐哈尔医学院研究室提供。

2　方法

2.1药物分组

将人参多糖注射液分成20、40、60、80、100 mg/mL为实验组，药物稀释用培养基，空白组也加培养基。

2.2荧光免疫法

取对数生长期的人肝癌BEL-7402、HepG2两株细胞，用培养基按1：40稀释，接种在放有载玻片上的6孔板内，放入37℃、5%CO2培养箱培养48 h。将载玻片取出，在超净台中滴加4%多聚甲醛到载玻片上将细胞固定，5%胎牛血清的PBS封闭细胞，一抗 （按1：100稀释）4℃过夜，PBS洗片5 min×3次，滴加二抗（结合异硫氰酸荧光素），PBS洗片5 min×3次，用4，6-二脒基-2-苯基吲哚染细胞核，PBS冲洗5 min×3次，95%甘油封片，观片，拍照。

2.3 CCK8检测细胞增殖抑制

取对数生长期的人肝癌BEL-7402、HepG2两株细胞，用培养基按1：40稀释，接种在96孔板内，培养一天，镜下观察细胞形态，每孔加20、40、60、80、100 mg/mL人参多糖注射液，对照组加培养基，每孔设3个复孔，板周不加药，为防止边缘效应。放入37℃，5%CO2培养箱培养24、48、72 h，显微镜下观察细胞形态，并拍照。吸出培养基及药物，向每孔加100 μL培养基和10%CCK8，放入37℃，5%CO2培养箱培养1h，测吸光度（OD值）。利用OD值计算抑制率（inhibition rate，IR），抑制率=［1-（药物组OD值/对照组OD值）］×100%。

图1　　甘露糖受体在肝癌细胞系上的表达（×400）.A：HepG2 MR（CD206）；B：HepG2 DAPI；C：HepG2 Merge；D：BEL-7402 MR（CD206）；E：BEL-7402 DAPI；F：BEL-7402 Merge

3　结果

3.1荧光免疫法

甘露糖受体阳性表现为绿色荧光，在人肝癌BEL-7402和HpeG2两个细胞株上均检测到了甘露糖受体呈阳性表达，细胞核被4，6-二脒基-2-苯基吲哚染成蓝色荧光，可以看出甘露糖受体在人肝癌细胞BEL-7402上表达分布明显，而在人肝癌细胞HpeG2上表达分布相对不明显（见图1）。

3.2 CCK8检测结果

人参多糖注射液对人肝癌细胞BEL-7402和HepG2增殖有抑制作用，结果表明：在一定的浓度范围内，生长抑制率随浓度增加而增高，同时生长抑制率随时间延长而升高，存在时间和剂量依赖关系；而且，人参多糖注射液对人肝癌细胞BEL-7402的抑制率明显高于对人肝癌细胞HepG2的抑制率：人参多糖注射液浓度为8 mg/mL的条件下，培养24、48、72h，检查到的数据表明人参多糖注射液对人肝癌细胞BEL-7402的增殖抑制作用明显高于对人肝癌细胞HepG2增殖抑制作用（P＜0.05，表1）。

表1　　人参多糖注射液对人肝癌细胞BEL-7402、HepG2增殖抑制率比较

4　讨论

甘露糖受体（Mannose receptor，MR）作为甘露糖受体家族成员之一，20世纪70年代第一个被发现，是分子量为175KD的跨膜糖蛋白，MR为I型跨膜受体，可识别和结合不同的糖类分子，以甘露糖、岩藻糖与MR结合能力最强，N-乙酰葡萄胺、葡萄糖次之，半乳糖不能与MR结合［5-6］。学者们［7-8］利用巨噬细胞上有广泛的MR表达这一特性，研究不同多糖通过MR途径发挥免疫调节作用。田维毅等［4］利用巨噬细胞建立了甘露糖受体模型，用以筛选中药多糖中的MR结合成份及药理作用。汪炳瑞等［9］证明铜绿假单胞菌可以抑制胰腺癌细胞生长，此抑制作用是通过铜绿假单胞菌上的多糖与MR识别结合实现的。近年来研究发现其还分布于阴道上皮细胞等［10］表面，通过以上的研究表明多糖可通过MR这一靶点而发挥药理作用，据此推测如果在人肝癌细胞BEL-7402、HepG2上能检查到MR的大量表达，人参多糖作为一种多糖也可通过与MR结合而发挥药理作用，并且，如果MR在两个细胞系上表达分布的量不同，那么所产生的药理作用的强弱也会不同。基于此想法我们检测了MR在人肝癌细胞BEL-7402、HepG2上的表达分布情况，本实验表明MR在肝癌细胞BEL-7402上表达丰富，而在人肝癌细胞HepG2上的表达情况显着高于肝癌细胞BEL-7402明显；同时本研究还证明人参多糖注射液对人肝癌细胞BEL-7402、HepG2的增殖都有明显的抑制作用，这种抑制作用初步观察是由于人参多糖注射液诱导肿瘤细胞凋亡引起的；同时，我们又进一步检测、分析了人参多糖注射液对两株肝癌细胞的增殖抑制率与MR在两株肝癌细胞上表达差异的关系，此部分实验证实人参多糖注射液对MR表达丰富的人肝癌细胞BEL-7402抑制率高，而对MR表达分布较差的人肝癌细胞HepG2抑制率较低，两者进行统计学分析人参多糖注射液对两株细胞的增殖抑制率有明显差别，通过上述实验我们推测人参多糖注射液对人肝癌细胞BEL-7402、HepG2的增殖抑制是通过甘露糖受体途径实现的。

总之，通过上述实验表明人参多糖注射液对人肝癌细胞BEL-7402、HepG2的增殖存在明显的抑制，并且对两者的抑制作用是有差别的，这种抑制作用可能是通过促进细胞凋亡实现的，同时我们观察到这种差别可能与MR在人肝癌细胞BEL-7402、HepG2上表达差别呈正相关。目前实验还存在许多机制不清的问题，像甘露糖受体诱导肝癌细胞凋亡的分子机制是什么等问题，有待我们进一步开展实验证明。

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［中图分类号］R285

［文献标识码］A

［文章编号］2096-1782（2016）01-0007-04

［基金项目］黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目（No：12531831）。

［作者简介］郭林娜（1978.7-），女，黑龙江齐齐哈尔人，硕士，讲师，研究方向：肝癌的中药治疗，E-mail：30547814@qq.com。

收稿日期：（2015-12-19）

The mannose receptor mediated ginseng polysaccharide injection on liver cancer cell proliferation inhibition

GUO Linna1，GAO Hengyu1，HE Miao2，LIU Dan3
1.Department of Anatomy Qiqihar Medical University，Heilongjiang 161006；2.Department of Pathology，Daqing Oil Field General Hospital，Heilongjiang 163000；3.Department of Biological Genetics Qiqihar Medical University，Heilongjiang 161006

［Abstratct］Objective To study the mechanism of ginseng polysaccharide injection on the proliferative inhibition of hepatoma cell line BEL-7402 and HpeG2 as well as the relationship between the ginseng polysaccharide injection and expression level of mannose receptor.Methods Experiment was carried out in the laboratory center of Qiqihar Medical School in June 2014，Fluorescence immunoassay was used to detect the expression levels of mannose receptor in hepatoma cell line BEL-7402 and HpeG2.Cholecystokinin octapeptide（CCK8）was used to observe proliferative inhibition of cells.Results By immunofluorescence，it was detected that the weak expression and distribution of the mannose receptor in hepatoma cell line HpeG2，but high expression and distribution in BEL-7402.By CCK8，ginseng polysaccharide injection could effectively inhibit the proliferations of BEL-7402 and HpeG2 within certain concentration range（P＜0.05），which was positively correlated with concentration and time.And there was more significant anti-proliferative effect on BEL-7402 than HpeG2（P＜0.05）. Conclusion Ginseng polysaccharide injection could effectively inhibit the proliferations of hepatoma cell line BEL-7402 and HpeG2.Anti-proliferative effect on BEL-7402 is more significant than HpeG2.The anti-proliferative effect is positively correlated with expression of the mannose receptor.

［Key words］Hepatocellular carcinoma；ginseng polysaccharide injection；Mannose receptor；Apoptosis