乌鸡黑色素的提取和测定及黑色素过度沉积相关基因的研究进展

蒋 明，李 智，董莲花，陈 斌*(1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128;2.畜禽遗传改良湖南重点实验室，湖南 长沙 410128)



乌鸡黑色素的提取和测定及黑色素过度沉积相关基因的研究进展

蒋 明1,2*，李 智1,2，董莲花1,2，陈 斌1,2**
(1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128;2.畜禽遗传改良湖南重点实验室，湖南 长沙 410128)

摘 要：乌骨鸡具有极高的药用价值、营养价值和观赏价值，而这些价值的物质基础主要是黑色素。本文就乌鸡黑色素的提取、测定方法及其及过度沉积相关基因等方面的研究进展进行了阐述。

关键词：黑色素；紫外分光光度计；纤维黑色素基因；真皮黑色素抑制基因；提取方法

乌骨鸡在我国饲养历史上已经有将近两千多年了，遍布云南、贵州、陕西、浙江及江西等省，其具有乌骨、乌皮、乌肉、凤头、五爪、丛冠、绿耳、毛腿、丝毛和胡须十大特征[1]。近代医学研究表明，乌鸡最重要的实用价值和药用价值在于其机体内部沉积大量的黑色素，而且许多研究也发现，乌鸡的黑色素具有清除机体的自由基、延缓衰老、抗紫外线、抗氧化和提高机体免疫力等生理功能。本文综述了乌鸡黑色素的提取、测定方法及其及相关基因等方面的研究进展。

1 黑色素的提取方法

乌鸡黑色素是一类结构非常复杂、而且在体内与蛋白质紧密结合不易分开的多聚体[2]，因此，提取黑色素的关键就在于如何剔除黑色素中的蛋白质。目前用于提取乌鸡黑色素的主要方法有盐酸水解提取法和酶水解提取法。

1.1 盐酸水解提取法

盐酸水解提取法是黑色素提取的最早的一种方法，这种提取方法对于黑色素的化学结构以及形态结构都有一定的破坏。但是，这种方法简单，容易操作，而且提取的黑色素光稳定性也比较好。徐顶巧等[3]利用单因素实验的方法以及响应面的分析方法对盐酸提取过程中的料液比、盐酸浓度和提取时间进行研究；结果表明：当盐酸浓度为27 %，提取时间为6 h，料液比(m∶V)为1∶2时，黑色素的得率为最高，达到了4.72 %。桑宏庆等[4]对料液比、浸提次数和提取温度进行了优化，最终确定温度为40 ℃，浸提次数为3次，料液比为1∶2的条件为最佳，提取率为0.37 %。朱方等[5]研究表明，提取的最佳工艺条件为：温度为95 ℃，提取时间为2 h，料液比为1∶4。刘永忠等[6]对乌鸡胸肌和鸡皮等不同部位的提取条件也进行了不同的优化，并且制定了相应的提取方案。目前的研究进展表明，盐酸提取方法的最佳工艺仍然存在一定的分歧，原因可能是由于所取乌鸡的种类和提取器官的不同导致的，但是其基本操作流程还是一样的：取一定量的乌鸡组织，绞碎，浓盐酸浸泡一定的时间，然后抽滤，最后洗涤，真空冷冻干燥得到黑色素粗品。

1.2 酶水解提取法

由于酸提取黑色素的方法容易损伤黑色素的化学及形态结构，而且提取过程中的回流耗时长，能量也消耗大，较为繁琐，因此国内外许多科研工作者开始研究利用蛋白酶来水解提取黑色素。蔡华珍等[7]从蛋白酶的种类、加酶量、pH、酶解温度和酶解时间等方面来对蛋白酶提取黑色素进行研究，结果表明消化液中氨基态氮含量与乌鸡黑色素分离得率呈极显著的线性相关，消化液中的氨基态氮含量可以作为黑色素含量的一种间接表示。在此次试验中还发现，酸性蛋白酶对乌鸡蛋白质的水解能力大于木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶大于中性蛋白酶，而中性蛋白酶强于碱性蛋白酶。酸性蛋白酶的最佳水解条件为：pH为2.8，温度为34.8 ℃，加酶量为3.8 %，酶解时间为20 h；而且还发现在总酶量不变的前提下，分两次加入比单独一次性加入效果更好。张恒业等[8]采取分步酶解法提取乌鸡黑色素，首先利用复合蛋白酶水解乌鸡肉末，然后再利用酸性蛋白酶水解，酸性蛋白酶的酶解条件参考蔡华珍等实验，而复合蛋白酶最佳条件为酶的加入量为3.5 %，pH 为6.5，酶解时间为3 h。实验结果表明，采取分布法提取黑色素的得率高，而且对维生素C也有一定的保护能力。

除了上述方法之外，也有科研工作者将酶提取和酸提取方法结合一起用，周伟伟等[9]将乌鸡肉样在中性的条件下，利用木瓜蛋白酶酶解3 h，将其离心后的沉淀物，经过盐酸回流，抽滤，最后冷冻干燥获得黑色素，研究发现此方法不仅耗时少，而且该方法获得的乌鸡黑色素的纯度也相对较高。

2 黑色素的测定

2.1 紫外风光光度计法

乌鸡黑色素含量的研究有一段时间普遍使用重量法，这种方法在操作上比较方便，而且运用起来也非常的简单，但是其中存在一个问题，就是那些样品中不溶于水的杂质，它们的存在会对实验结果造成极大的误差。近年来研究结果表明，黑色素在可见光下没有其独特的吸收峰，而在紫外波长下，黑色素的吸收值达到最高，当波长增加时，它的吸收值会下降，因此现在许多科研工作者都采用紫外分光光度计法来度量黑色素的含量。Reedy等[10]研究发现，黑色素在530 nm下的吸光值相对偏低，因此将530 nm处的吸光值作为黑色素的相对含量，而Ito等[11]将黑色素经过碘化氢和含过氧化氢的氢氧化钠溶液处理后，测定其在350 nm下的吸光值，也有科研工作者用热的氢氧化钠溶液溶解黑色素组织，然后测定该溶液在500 nm下的吸光值来确定黑色素的总含量，该方法主要适用于只含有脱黑色素的组织，由于真黑色素很难溶于碱中，但在后来的研究发现，无论是真黑色素还是脱黑色素都能溶解在闪烁液Soluene-350∶水=9∶1(v∶v)的混合液中，而在500 nm下的吸光值与黑色素的含量呈正相关，因此常用A500作为黑色素的含量[12,13]。Del等[13]还发现脱黑色素和真黑色素在500 nm和650 nm下的吸光值有着非常大的区别，因此可以将其在Soluene-350混合液中的A500/A650预测脱黑色素和真黑色素的比例情况。

2.2 液相色谱法

液相色谱测定黑色素的原理是：由于真黑色素由二羟基吲哚(DHI)和二羟基吲哚羧酸(DHICA)组成，脱黑色素主要由半胱氨酸和酪氨酸的衍生而成，DHICA和DHI在强氧化剂的氧化下分别生成二羧酸吡咯(PDCA)和三羧基吡咯(PTCA)，脱黑色素经过碘化氢处理生成氨基羟基苯基丙氨酸(AHP)，因此可以通过液相色谱法测定PTCA和PDCA及AHP分别作为真黑色素和脱黑色素含量的指标[14,15]。孙亚真等[16]通过对泰和丝羽乌骨鸡的研究，建立了对PDCA和PTCA液相色谱测定的体系，利用KromasilC18柱进行分离和二极管矩阵检测器进行检测，测定过程以甲醇-0.1 %甲酸作为流动相，然后梯度洗脱，269.8 nm和282.8 nm为检测波长，最后结合LC-MS的方法对实验结果的色谱峰进行定性判断，该方法使得PTCA和PDCA很好地分离开来，测定结果表明乌骨鸡黑色素含量为76.33 μg/mg。王欢欢等[17]通过研究发现了一个能够同时测定乌鸡肉中肌苷酸和黑色素的液相色谱体系，其利用过氧化氢在碱性环境下将黑色素样品进行氧化，然后将氧化产物与肌苷酸待测液混合，分离柱与孙亚真一样，仍然使用C18柱进行分离，但其检测波长为270 nm，流动相为甲醇-磷酸/三乙胺，洗脱方式也不一样，为等度洗脱，该方法能够快速地将肌苷酸和黑色素同时检测出来。以上科研工作者在该方法的流程细节上有少许的不同，那可能是因为实验的目的、实验的材料差别所导致的，但是二者均告诉我们，利用液相色谱测定黑色素的方法相对于紫外分光光度计测定方法灵敏、可靠，而在实际操作中，应根据具体需求，做相应的调整。

3 黑色素过度沉积相关基因

乌鸡的超黑色素化是其体内过度沉积黑色素所导致的，研究结果表明其是由少量的基因调控的一种质量性状[18]。控制乌鸡黑色素过度沉积的主要基因座有Z染色体上的真皮黑色素抑制基因(DermalMelanin Inhibitor，ID)和20号染色体上的纤维黑色素基因(Fibromelanosis，FM)[19,20]。皮肤中的黑色素由两部分组成：表皮黑色素和真皮黑色素，真皮黑色素细胞主要分布于含磷状的胫骨中，该处黑色素的沉积主要受ID基因控制，ID基因是一个复等位基因，有idA、Id、idM和idC四个等位位点，隐性表达时，胫骨表现为黑色。横斑基因(B)与其连锁距离为13cM[21]。ID基因野生型为隐性，显性Id能够抑制真皮黑色素的沉积，即只有当基因型为id/id 或id/W时，鸡的胫骨表型才为黑色。FM基因则相反，显性Fm能够促进黑色素的沉积。但是ID基因对FM基因有上位效应，故乌鸡基因型为Fm/-,id/id或者Fm/-,id/W[22,23]。Dorshorst等[24]研究结果表明，ID基因定位与Z染色体的67.1 Mb～72.3 Mb区域，而FM基因定位在20号染色体10.3 Mb～13.1 Mb区域。田明等[25]利用密度更高的SNP芯片对FM和ID区域进行定位，并结合aCGH芯片检测技术，对FM和ID基因进行定位，实验结果表明FM基因区域存在两段拷贝数变异(Copy Number Variation，CNV)—CNV-1和CNV-2，推测其CNV结构形式为两个CNV-1之间有一个180度颠倒的CNV-2，最后再与一个正常的CNV-2相连，二者之间间隔417 kb(图1)，ATP5e、END3、TUBB1、SLMO2位于CNV-1内，END3基因可能是其中的关键基因。FEM1C、ALDH7A1和MTAP定位于ID区域，而MTAP可能是ID基因座上的关键基因。除了上述两个区域对乌鸡黑色素沉积有关联外，也有学者发现MC1R[26]、TYP[27]、TYRP1[28]和MITF[29]基因与黑色素的沉积也有一定的关联。

参考文献：(29篇，略)

中图分类号：S831.2

文献标识码：A

文章编号：1001-0769(2016)04-0077-03

基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金资助(CARS-36)。

*作者简介：蒋明，男，湖南郴州人，硕士研究生，研究方向：动物遗传育种，E-mail:jiangming598@126.com。

**通信作者：陈斌，教授，博士生导师，E-mail:chenbin7586@126. com。