猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

劳秀杰，王静静，郑东霞，邵春艳，何海建，王晓洁，王志亮，王晓杜，宋厚辉（.浙江农林大学动物科技学院，浙江杭州 00；.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 660；.金华职业技术学院农业与生物工程学院，浙江金华 007）



猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

劳秀杰1，王静静2，郑东霞2，邵春艳1，何海建3，王晓洁1，王志亮2，王晓杜1，宋厚辉1
（1.浙江农林大学动物科技学院，浙江杭州 311300；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.金华职业技术学院农业与生物工程学院，浙江金华 321007）

摘 要：根据GenBank报道的N基因高度保守核苷酸序列，设计并合成一对引物。上下游引物与GenBank中登录的153株猪流行性腹泻病毒（PEDV）N基因全长序列匹配度分别是100%和97%。以本实验室分离流行毒株为模板，利用SYBR Green I荧光染料法进行RT-PCR扩增，获得扩增产物构建重组质粒作为阳性对照，建立检测猪流行性腹泻病毒核酸的方法。同一样品进行3次重复试验，变异系数＜0.9%。通过对临床样品进行检测和测序验证，核酸检测结果中的阳性样品准确率为100%。本研究所建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏、准确等优点，可用于临床PEDV的检测及分子流行病学调查。

关键词：猪流行性腹泻病毒；N基因；实时荧光定量RT-PCR；检测

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起猪的一种高度接触性肠道传染病，其特征为呕吐、腹泻、脱水［1］。本病主要发生在当年12月至次年2月，夏季也可发生，可以感染各年龄阶段的猪，其中哺乳仔猪最易感，发病率可达100%，平均死亡率可达50%。PED最早报道发生于英国和比利时，随后在中国、加拿大、匈牙利、德国、日本及韩国等国家流行，给全世界养猪业造成巨大的经济损失［2］。PEDV是有囊膜的单股正链RNA病毒，编码4个蛋白，分别为纤突蛋白（Spike，S）、小膜蛋白（Envelope，E）、膜蛋白（Membrane，M）、核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N）。由于蛋白在PEDV病毒中数目最多，且高度保守，因此可以用此基因建立PEDV分子生物学诊断方法［3-7］。自2010年以来，PED在国内流行，给养猪业造成巨大经济损失。为了能及时发现该病毒，避免不必要的经济损失，本研究根据PEDV高度保守的N基因核苷酸序列，设计合成了一对特异性荧光定量PCR引物并建立了一种可快速、灵敏、特异地检测PEDV的荧光定量PCR方法。

1　材料与方法

1.1生物材料

猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪圆环病毒2型（PCV2）均由本实验室保存。

1.2主要试剂

2×SYBR.premix、ExTaq GC、Rox reference Dye II、DNA Maker DL2000、反转录试剂盒、质粒小提试剂盒购自Takara公司；DNA凝胶回收试剂盒购自生工公司；Trizol试剂盒购自Invitrogen公司；零背景快速连接试剂盒购自TIANGEN公司。

1.3引物设计

根据GenBank登录的PEDV的N基因核苷酸序列分别在（723-1286 bp）和（1001-1180 bp），用Primer 5.0软件设计了常规PCR引物和荧光定量PCR引物。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列见表1和表2。

表1　常规PCR引物

表2　荧光定量PCR引物

1.4荧光定量PCR检测体系的建立

1.4.1病毒RNA提取。收集感染了72 h PEDV的Vero细胞沉淀，加入Trizol试剂中，振荡混匀；然后4℃，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液转移至空的1.5 mL离心管。加入200 μL氯仿，振荡15 s，室温静置3 min，4℃，1 2000 r/min离心10 min，吸取上清液转移至空的1.5 mL离心管。加入等体积的氯仿，剧烈振荡15 s，室温静置3 min ；4℃，1 2000 r/min离心10 min，吸取上清液转移至空的1.5 mL离心管中。加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀后，室温静置10 min，4℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清。加入用DEPC水配制的70 %乙醇洗涤沉淀1次，4℃，12000 r/min离心5 min，弃上清，室温干燥后溶于适量的RNase free水中，用紫外分光光度计测定浓度及纯度，-80℃保存备用。

1.4.2cDNA 反转录。根据AMV反转录试剂盒说明书进行反转录，所得cDNA置-20℃保存。

1.4.3常规PCR扩增。反应体系为：25 mmol/ L MgSO42μL，10× buffer 2.5μL，2 mmol/L dNTP 2.5μL，KOD plus 酶1μL，PEDV cDNA 2μL，上下游引物各0.5μL，ddH2O 14μL。反应条件为：94℃3 min，1个循环；98℃ 10 s，60℃ 30 s，68℃ 30 s，30个循环；68℃ 5 min，1个循环。

1.4.4标准模板的制备。按照胶回收试剂盒说明书割胶回收1.4.3扩增的目的片段，并将其与零背景载体连接，随后转化到大肠埃希菌Escherichia coli 感受态细胞DH5α，摇菌提取质粒，经鉴定正确后测定OD260值，将其浓度换算成拷贝/μL，放置-20℃备用。

1.4.5 荧光定量PCR扩增。已优化的荧光定量PCR反应体系20 μL，其中2×SYBR Green I premix 10 μL，辅助染料0.4 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，模板1μL，ddH2O 7.8μL。采用三步法扩增反应条件：第一步95℃ 30 s，1个循环；第二步95℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环；第三步95℃ 1 min，60℃ 30 s，95℃ 30 s，1个循环。

1.4.6标准曲线和溶解曲线的建立。以10倍梯度稀释的阳性标准模板，模板浓度为1×109～1×100copy/μL，进行荧光定量PCR扩增，并设置阴性对照。利用荧光定量PCR仪随机附带的软件分析标准曲线和溶解曲线。

1.4.7灵敏度试验。以10倍梯度稀释标准模板，模板浓度为1×109～1×100copy/μL，进行荧光定量PCR扩增，计算出荧光定量PCR检测模板的最低拷贝数，设置阴性对照。

1.4.8重复性试验。对同一阳性标准质粒设三个重复管，用建立的荧光定量PCR方法检测其重复性，计算其组内变异系数。

1.4.9特异性试验。用PEDV荧光定量PCR检测猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪圆环病毒2型基因组，确定该方法的特异性。

1.4.10临床样品检测。将采集的多个猪场病猪的肛门棉试子进行处理，提取RNA，用建立的荧光定量PCR方法检测，同时设阳性和阴性对照。

2　结果

2.1标准品的制备

用特异性引物对PEDV进行PCR扩增，所得目的片段564 bp且无非特异性条带（图1），将阳性质粒的测序结果在美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站上进行BLAST，同源性达99%。

2.2标准曲线和溶解曲线的建立

用10倍梯度稀释的阳性标准模板进行荧光定量PCR扩增，模板浓度分别为1×109～1×100copy/μL，用荧光定量PCR仪附带的软件分析即得到标准曲线（图2）和溶解曲线（图3）。标准曲线R2=1.000，斜率为-3.200，截距为36.58， Eff=105.4%。溶解曲线峰型锐利，熔解温度一致Tm值为81.7℃，没有引物二聚体和非特异性产物等其它峰值出现。

图1　PEDV N基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析

图2　荧光定量PCR标准曲线

图3　荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线

2.3灵敏度试验

将质粒标准模板稀释10个不同浓度，分别是 1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copy/μL，进行荧光定量PCR扩增，结果显示检测有效值至1×100copy/ μL（图4），比常规PCR （1×102copy/μL）的灵敏度高100倍（图5）。

图4　荧光定量PCR灵敏度分析

图5　PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析

2.4特异性试验

分别以TGEV、PRRSV、CSFV和PCV2的核酸作为模板，用PEDV荧光定量PCR检测，并设阳性对照和阴性对照，结果显示只有PEDV阳性模板产生荧光信号（图6），表明设计的荧光定量PCR检测引物有良好的特异性。

2.5重复性试验

图6　荧光定量PCR的特异性分析

选取1×106，1×105，1×104copy/μL的三个标准模板进行扩增，每个标准模板做三个重复进行组内和组间重复性试验，结果显示组内重复性试验的3个标准品的变异系数低于0.9%（表3）；组间重复性试验的3个标准品的变异系数低于0.9%（表4），表明PEDV荧光定量PCR检测方法有较好的重复性。

表3　荧光定量PCR组内重复性分析

表4　荧光定量PCR组间重复性分析

2.6临床样品检测

采取3个不同猪场疑似PEDV感染的病猪肛门拭子共计18份，收集细胞毒提取核酸进行检测，结果显示14份样品呈现阳性，扩增曲线、溶解曲线见图7、图8。扩增所获得的序列进行测序验证，结果表明所获得序列全部为PEDV病毒核酸序列。阳性样品准确率为100%，表明该样品存在PEDV核酸。

3　讨论

图7　荧光定量PCR检测临床样品扩增曲线

由于PEDV与TGEV在流行病学、临床症状和病理变化等方面很难区分，所以建立快速、准确的实验室检测方法尤为重要［8-9］。目前检测PEDV的方法有，PCR技术［10-11］、以RT为基础的环介导等温扩增（RT-LAMP）技术［12］、ELISA实验［13］、胶体金免疫层析实验［14］、限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）实验［5］等。PCR技术是近年来发展起来的新技术，较其他几种检测方法更简便、快速、准确。SYBR Green I 实时荧光定量PCR技术主要是在常规PCR基础上加入SYBR Green I 荧光物质对核酸进行定性定量检测，与常规PCR比较，具有重复性好、灵敏度高、定量准确、工作效率高、成本低廉等优点，并可避免由扩增产物交叉污染所导致的假阳性，同时适用于高度变异的基因检测。

图8　荧光定量PCR检测临床样品溶解曲线

由于实时荧光定量PCR检测技术优于其他分子生物学检测技术，因此被世界动物卫生组织（OIE）认可并推荐应用于畜禽疾病的检测。然而荧光定量PCR检测结果受很多因素的影响，如：样品的来源及处理、提取核酸的方式方法、核酸的质量、实验操作技能、实验操作环境、PCR仪器的选择、反应体系和反应条件等。其中，最重要的影响因素是引物的设计。因此，在引物设计时要考虑到GC含量、退火温度、长度、保守性以及与流行毒株的匹配度等方面的问题，在引物设计过程中考虑到的问题越全面，实验结果越准确、可靠。

本研究根据PEDV N基因设计一对可扩增出564 bp目的片段的引物，构建阳性对照，同时用另外一对扩增180bp的引物进行荧光定量RT-PCR。标准曲线线性关系良好，相关系数为1.0，扩增效率为105.4%。溶解曲线峰型锐利，熔解温度一致，Tm值为81.7℃，没有引物二聚体和非特异性产物。灵敏度高，最低检出线为1×100copy/μL ；特异性强，与其它猪病病毒无交叉反应；耗时短，整个过程只需105 min，且批内批间重复性试验的变异系数低于0.9%。以上结果表明建立的SYBR GreeenⅠ实时荧光定量PCR检测方法特异、敏感、快速、重复性好，不仅可以快速准确诊断PEDV，还可用于PEDV流行病学调查、疫苗效价评估和致病机理等方面的研究，适合临床推广应用。

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（责任编辑：朱迪国）

中图分类号：S852.65

文献标识码：A

文章编号：1005-944X（2016）01-0062-05

基金项目：浙江省科技厅项目（2014C32061，2014C02003）；金华市农业类重点研究项目（2014-2-003）

通讯作者：宋厚辉，王晓杜

Development of Real-time Quantitative RT-PCR Method for Detecting Porcine Epidemic Diarrhea Virus

Lao Xiujie1，Wang Jingjing2，Zheng Dongxia2，Shao Chunyan1，He Haijian3，Wang Xiaojie1，Wang Zhiliang2，Wang Xiaodu1，Song Houhui1
（1.College of Animal Science and Technology，Zhejiang A&F University，Hangzhou，Zhejiang 311300；2. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；3. School of Agricultural and Biological Engineering，JinHua Polytechnic，Jinhua，Zhejiang 321007）

Abstract：A pair of primers was synthesized according to the conservative sequence of PEDV N genes that have been retrieved from GenBank. The forward and reverse primers were aligned with 153 full-length sequences of PEDV N genes，and exhibited identifi es of 100% and 97%，respectively. The fl uorescent dye SYBR Green I was used to develop the real-time RT-PCR method. The N gene of an isolated PEDV was amplifi ed by RT-PCR，subcloned into a plasmid，and then was used as a positive control. The coeffi cient of variation was less than 0.9% in triplicate assays. Based on positive clinical samples，100% agreement was achieved by using this real-time RT-PCR method. This method would be useful in diagnostic analysis against PEDV in epidemiological investigations.

Key words：porcine epidemic diarrhea virus；N gene；real-time fl uorescent quantitative RT-PCR；test