沼液生物厌氧发酵对病死猪病原微生物杀灭效果的评价

袁万哲，郑丽丽，刘天驹，杨旭光，王 迈，张永辉，王玉清（.河北农业大学动物医学院，河北保定 0700；.河北省动物疫病预防控制中心，河北保定 07000；.衡水市动物疫病预防控制中心，河北衡水 05000；.石家庄市动物卫生监督所，河北石家庄 050000）



沼液生物厌氧发酵对病死猪病原微生物杀灭效果的评价

袁万哲1，郑丽丽2，刘天驹2，杨旭光3，王 迈4，张永辉3，王玉清2
（1.河北农业大学动物医学院，河北保定 071001；2.河北省动物疫病预防控制中心，河北保定 071000；3.衡水市动物疫病预防控制中心，河北衡水 053000；4.石家庄市动物卫生监督所，河北石家庄 050000）

摘 要：为评估利用沼液无害化处理病死猪的效果，无菌采集病死猪沼液生物厌氧发酵样品，利用PCR技术对样品中的猪瘟病毒、圆环病毒2型、蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪链球菌与副猪嗜血杆菌等7种常见病原微生物进行了检测，同时应用细菌培养基与PK-15细胞对猪链球菌、副猪嗜血杆菌以及猪瘟病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒2型进行了病原分离。结果显示，田间试验组和模拟平台试验组，在不同温度条件下，应用沼液对病死猪进行3个月或6个月的厌氧发酵，病原微生物核酸检测或病原分离鉴定均为阴性，证实应用沼液无害化处理病死猪能有效杀灭其中的病原微生物，使其失去活性。

关键词：沼液；无害化处理；检测；PCR

病死动物的无害化处理事关动物疫病的有效控制、畜牧业的健康发展和社会公共卫生的安全。目前国内外采用的无害化处理技术主要包括深埋、焚烧、化制等，存在造价高、费时费工、污染环境等缺陷。为改进、规范、创新现有的病死动物无害化处理方法和技术，探索低成本、便操作、易接受、适民情、节能源、减排放、符环保、再利用的病死动物无害化处理新方法和新技术，在传统化尸池处理病死动物方法的基础上，本着“务实创新、科学规范”的原则，2014年开展了“应用沼液无害化处理病死动物相关技术”的研究工作，在河北省衡水市武邑县、绕阳县等地设立了野外田间实验区（点）和室内人工模拟试验平台，经过近1年多的初步试验，取得了阶段性成果。现对利用沼液生物厌氧发酵无害化处理技术对病死猪的病原微生物杀灭效果进行评价。

1 材料和方法

1.1 样品

采自衡水市武邑县、饶阳县试验点野外化尸沼液池以及实验室人工模拟化尸瓶，样品均为随机采集经过不同时间沼液发酵的病死猪组织或骨头。其中2份来自武邑，2份来自饶阳，2份来自实验室。

1.2 主要试剂

2×Taq Mix、dNTPs、DL2000 DNA Marker 购自宝生物工程（大连）有限公司；病毒RNA/DNA提取试剂盒购自全式金（北京）生物科技有限公司；反转录酶M-MLV（200U/uL）、5×M-MLV Buffer、0.1M DTT购自Promega公司；THB培养基购自青岛海博生物技术有限公司。

1.3 引物设计与合成

PCR检测方法为本实验室自建［1-2］，所用引物见表1。其中，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）预扩增片段为691 bp（高致病性毒株）或781bp（经典毒株）；猪瘟病毒（CSFV）预扩增片段为186 bp；猪伪狂犬病毒（PRV）预扩增片段为349 bp；猪圆环病毒2型（PCV2）预扩增片段为440 bp；猪流行性腹泻病毒（PEDV）预扩增片段为477 bp；副猪嗜血杆菌（Hps）预扩增片段为276 bp；猪链球菌（SS）预扩增片段为466 bp。引物均由生工（上海）生物技术有限公司合成。

表1 PCR引物

1.4 核酸提取

将含病死猪组织的沼液5 000 rpm离心10 min后取沉淀加双蒸水重悬，于100℃水浴10 min后立即冰浴冷却5 min，12 000 rpm 4℃离心5 min，取上清液作为细菌检测模板备用。将含病死猪猪组织的沼液5 000 rpm离心10 min，吸取上清，用病毒RNA/DNA提取试剂盒提取核酸作为病毒检测模板备用。骨头样本抽取骨髓，刮取骨表面物质提取核酸备用。

1.5 PCR扩增

根据目的片段采用相应下游引物，参照M-MLV反转录酶使用说明书进行操作。在20 μL体系里，依次加入RNA 样品、dNTPs（10 mM）、下游引物（10 pM）、5×MLV Buffer、RRI（RNA酶 抑制剂）、DTT（0.1M）和MLV反转录酶，42℃反转录 1 h，反转录得到的产物作为PCR模板。将所有待检样本，在20 μL体系里，按照比例加入2×Taq Mix、模板引物（10 pM）和dd H2O，94 ℃预变性3 min，94 ℃预变性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环；72℃延伸10 min。同时设立以水为模版的阴性对照。PCR结束后，取5 μL PCR扩增产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.6 病原分离

利用THB培养基（含NAD）分离猪链球菌与副猪嗜血杆菌，利用PK-15细胞分离样本中伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型与猪瘟病毒。

1.6.1 细菌分离。将沼液直接接种THB培养基，挑选链球菌与副猪嗜血杆菌可疑菌落传代，通过革兰氏染色与PCR进行检测。

1.6.2 病毒分离。将沼液滤过处理之后，30 000 rpm超速离心1 h，弃掉上清，用细胞培养液洗涤沉淀，再超速离心，用细胞培养液悬浮沉淀后接种PK-15细胞，逐日观察细胞病变，如此盲传3代，收获细胞培养物，采用PCR检测伪狂犬病毒、猪瘟病毒与猪圆环病毒2型。

2 结果

2.1 经过不同时间生物厌氧发酵病死猪的病原PCR检测

病死猪发酵前（0月）、发酵后（3月、6月），分别采集发酵猪组织或骨头进行PCR检测，部分样本的病原微生物核酸检测阳性，结果见表2。

表2 样本的PCR检测结果

2.2 经过不同时间生物厌氧发酵病死猪的病原分离鉴定

选择病原微生物核酸检测阳性样本进行病原分离鉴定。将发酵3个月、6个月的样本处理后，选择THB培养基进行细菌分离，接种培养基后观察细菌生长，挑选至少10个疑似链球菌与副猪嗜血杆菌菌落纯化、革兰氏染色以及PCR鉴定，结果未见链球菌与副猪嗜血杆菌。将发酵3个月、6个月的样本处理后，接种PK-15细胞，盲传3代后未见细胞病变。PCR鉴定后未检出猪瘟病毒、伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型。

结果表明应用沼液对病死猪进行3个月或6个月的生物厌氧发酵，病原微生物已失去活性。

3 讨论

病死畜禽的无害化处理是消灭传染源最有效和最彻底的措施，特别是当前正值重大动物疫病防控的重要阶段和食用农产品质量安全水平全面提升的关键时期［3］。应用沼液生物厌氧发酵技术无害化处理病死动物，具有操作简便、成本低廉、环境友好等特点。然而经过发酵以后，病死猪所携带的病原微生物是否完全被杀灭或失去致病性，是决定沼液无害化处理技术是否有效的根本。本研究在流行病学调查的基础上，选择了5种既有DNA病毒、又有RNA病毒的，常发的和有代表性的病毒病病原，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒，同时还选择了2种分别是革兰氏阳性和革兰氏阴性的、具有代表性的细菌病病原：猪链球菌与副猪嗜血杆菌，开展了杀灭效果检测。经过3个月或6个月发酵后，部分发酵池病原核酸检测仍为阳性，这可能跟核酸本身的耐酸碱等性质有关。为进一步验证其活性，对检出的阳性样本处理后，接种PK-15细胞，有针对性地分离了阳性样本中猪瘟病毒、伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型。因为这三个病毒既有DNA病毒（猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型），又有RNA病毒（猪瘟病毒），既有囊膜病毒（猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒），又有无囊膜病毒（猪圆环病毒2型），具有代表性，且这三种病毒都可以利用PK-15细胞进行分离。细胞传代至3代，均未见细胞病变。收获样本，PCR检测均未检出猪瘟病毒、伪狂犬病毒与圆环病毒2型。同时将发酵3个月或6个月的样本处理后，选择THB培养基进行细菌分离，通过革兰氏染色以及PCR鉴定，未见链球菌与副猪嗜血杆菌，证实病死猪经过3个月或6个月发酵后，病原微生物已失去活性。

本沼液发酵利用保温技术措施，使全年池内温度基本保持在7～28℃之间。冬季池内最低温度为7℃，夏季池内最高温度可达28℃。经对整个发酵试验过程跟踪检测，发现每个试验组pH值的平均变化幅度在6.99～7.24之间。虽然发酵池发酵过程中的温度与pH值比较恒定，但依然出现这种杀灭效果，其原因初步认为跟营养物质缺乏以及厌氧等有关。随着发酵的进行，病死猪组织逐渐被发酵降解，病毒等微生物失去营养基质，同时氧气减少，

抑制了病原微生物的增殖。另据有关资料报道，沼液对细菌、病毒等微生物具有一定的抑制与杀灭作用。沼液生物厌氧发酵中是否还存在其他有效杀灭病原微生物的原因，目前正在进一步研究中。

参考文献：

［1］ Yuan W，Li Y，Li P，et al.Development of a nanoparticleassisted PCR assay for detection of porcine epidemic diarrhea virus［J］.J Virol Methods.2015，220：18-20.

［2］ 左奕，王建永，袁万哲，等.PCV2-PRV-PRRSV-CSFV多重PCR检测方法的建立［J］.中国兽医科学，2015，45（8）：771-775.

［3］王联芳，朱新华.病死畜禽无害化处理存在的问题及对策［J］.医学动物防制，2008，24（11）：876-877.

（责任编辑：朱迪国）

Evaluation on Inactivating Pathogenic Microorganisms from Dead Pigs by Anaerobic Fermentation Slurry

Yuan Wanzhe1，Zheng Lili2，Liu Tianju2，Yang Xuguang3，Wang Mai4，Zhang Yonghui3，Wang Yuqing2
（1.College of Animal Medicine，Hebei Agricultural University，Baoding，Hebei 071001；2.Hebei Animal Disease Prevention and Control Center，Baoding，Hebei 071000；3.Hengshui Animal Disease Prevention and Control Center，Hengshui，Hebei 053000；4.Shijiazhuang Animal Health Supervision Institute，Shijiazhuang，Hebei 050000）

Abstract：In order to evaluate the effects of bio-safety disposal of dead pigs by using biogas slurry，samples were collected from biological anaerobic fermentation slurry with pigs died of disease and detected for seven kinds of common pathogenic microorganisms including classical swine fever virus，porcine circovirus type 2，porcine reproductive and respiratory syndrome virus，pseudorabies virus，porcine epidemic diarrhea virus，streptococcus suis and haemophilus parasuis in samples by PCR.Meanwhile，pathogens including streptococcus suis，haemophilus parasuis，classical swine fever virus，pseudorabies virus and porcine circovirus type 2 were isolated by bacterial culture medium or PK-15 cells.After dead pigs were treated by biological anaerobic fermentation slurry over the past three or six months under different temperature conditions，the results on nucleic acid testing or pathogen isolation both were negative.The results indicated that biogas slurry could effectively inactivate pathogenic microorganisms from pigs died of diseases.

Key words：anaerobic fermentation slurry；bio-safety disposal；detection；PCR

中图分类号：S852.65

文献标志码：A

文章编号：1005-944X（2016）02-0026-04

基金项目：2014年度河北省畜牧兽医局科技项目“应用沼液无害化处理病死动物相关技术研究与应用”（2014-1-02）

通讯作者：王玉清，张永辉