通用型植物GFP标签蛋白表达载体的构建和蛋白质的细胞内定位研究

孟祥潮，刘国富，刘营，鲍岳，曹雪松Δ

(聊城大学 生命科学学院，山东 聊城 252059)

通用型植物GFP标签蛋白表达载体的构建和蛋白质的细胞内定位研究

孟祥潮1，刘国富1，刘营2，鲍岳2，曹雪松1Δ

(聊城大学 生命科学学院，山东 聊城 252059)

目的 构建通用型植物GFP标签蛋白表达载体，研究蛋白质的细胞内定位对蛋白质组学和代谢组学等研究的意义。方法 构建2种GFP标签蛋白质表达载体，分别在GFP的N和C端预留克隆位点，以克隆目的基因。利用该基因克隆载体，分别克隆内切酶FokI的切割结构域与MS2噬菌体外壳蛋白MCP的串联蛋白(FokI:MCP:FokI，FMF)至GFP的N和C端，得到FMF与GFP的融合蛋白GFP:FMF和FMF:GFP，其中FMF的N端带有细胞核定位信号。利用农杆菌介导植物瞬时表达侵染本氏烟草和洋葱表皮细胞，观察GFP荧光表达情况。结果 成功构建了2种融合了目的基因和GFP的表达载体pER35GFP-FMF和pER35FMF-GFP。激光共聚焦结果显示侵染了只含GFP载体的农杆菌的烟草细胞，可在细胞核和细胞质中检测到GFP的绿色荧光，而侵染了含核定位信号FMF：GFP和GFP：FMF 2种融合蛋白载体的农杆菌的烟草细胞，只在细胞核中观察到绿色荧光。结论 该载体系统可运用于研究蛋白质在植物细胞中的亚细胞定位，具有克隆简单、高效和通用性的特点。

亚细胞定位；植物表达载体；瞬时表达

利用绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)融合目的蛋白是目前研究蛋白质亚细胞定位、蛋白质动态变化和表达量等的有效方法。该方法不需要繁琐的样品制备过程，不受非特异性标记的影响，可在光学显微镜下直接进行观察[1]，是监测活细胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想标记，已被广泛用作报告基因，是进行体内蛋白质研究的重要实验方法[2-6]。GFP在蓝光激发下发出绿色荧光，可以与目标蛋白融合，作为荧光标记分子，特异性地观察蛋白质的亚细胞定位[7]。GFP能在蛋白质的N端或C端融合而保持其天然蛋白的特性，而且灵敏度高、对活细胞无毒害作用。GFP 在光照下是稳定的，各种光照都不会引起其变性，即使与其他蛋白质融合后，也能利用荧光显微镜很方便地检测，所以应用广泛[8]。GFP蛋白经激光扫描共聚焦显微镜激光照射后，可产生一种绿色荧光，从而对蛋白质进行精确定位。本实验旨在构建pER35GFP.1和pER35GFP.2系列表达载体，并将FMF融合蛋白构建入载体，对烟草叶片进行农杆菌侵染转化，再通过观察叶片中GFP的表达得到研究蛋白的定位情况。FMF融合蛋白中的FokI核酸酶和MCP(MS2噬菌体衣壳蛋白)[9]在天然状态下是不进入细胞核的，在融合蛋白FMF两端加上核定位信号可观察FMF融合蛋白进入细胞核情况，从而验证本系统的有效性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验植物、质粒和菌株:本式烟草(Nicotiana benthamiana)、质粒pER350和S18GFP.1及18M-1(含有FMF蛋白基因并且两端带有核定位信号)、农杆菌GV3101、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α均为本实验室保存。

1.1.2 试剂和引物:胶回收试剂盒、2×Taq PCR StarMix购自北京康润诚业生物科技有限公司。Probest DNA polymerase、T4 DNA连接酶和卡那霉素(Kan)等试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)。NCOI、BglII、speI等限制性内切酶购自New England Biolabs(NEB)或TaKaRa公司。普通生化试剂为国产分析纯。

1.1.3 仪器：FTC-200 PCR仪(FedBio公司);Tanon 3500R 凝胶成像系统(天能公司)；OLYMPUS BX51正置荧光显微镜(OLYMPUS公司)；Olympus FV1200双扫描激光共聚焦显微镜(OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 定位表达载体的构建:载体pER350先用NcoI酶切，柱纯化，再用SpeI酶切，回收8231bp片段，命名为pER350-1(3’、5’端分别为NcoI、SpeI)。

以S18GFP.1为模板扩增GFP基因，PCR产物GFP1(3’、5’端分别为NcoI、BglII位点)大小为733bp，将GFP1，adaptor ADGF1(adaptor ADGF1F、adaptor ADGF1R经过退火配对形成的DNA双链，3’、5’端分别为BglII、SpeI位点)及 pER350-1(3’、5’端分别为NcoI、SpeI位点)载体在T4 DNA连接酶作用下16 ℃连接过夜。连接后的产物进行转化实验，构建载体命名为pER35GFP.1。

以S18GFP.1为模板扩增GFP基因，PCR产物GFP2 (3’、5’端分别为BglII、SpeI位点) 大小为758bp，将GFP2，adaptor ADGF2(adaptor ADGF2F、adaptor ADGF2R经过退火配对形成的DNA双链，3’、5’端分别为NcoI、BglII位点)及 pER350-1(3’、5’端分别为NcoI、SpeI位点)载体在T4 DNA连接酶作用下16 ℃连接过夜。连接后的产物进行转化实验，构建载体命名为pER35GFP.2。

转化子经菌落PCR鉴定后挑取阳性克隆送华大基因公司测序，并用DNAMAN软件对测序结果进行分析。adaptor ADGF1 和adaptor ADGF2退火程序如下：94 ℃ 1min, 85 ℃ 1min, 75 ℃ 1 min, 65 ℃ 2min，55 ℃ 2min，45 ℃ 2min，25 ℃ 2min，3个循环。

1.2.2 融合FMF定位表达载体的构建:BglII酶切18M-1载体，胶回收 1708bp的FMF片段。载体pER35GFP.1、pER35GFP.2先用BglII酶切，柱纯化，回收载体片段，将FMF片段分别与载体pER35GFP.1、pER35GFP.2在T4 DNA连接酶作用下16 ℃连接过夜。连接后的产物进行转化实验，将转化子进行菌落PCR鉴定，得到融合FMF的定位表达载体pER35GFP-FMF、pER35FMF-GFP。FMF基因片段大小应为1708 bp。PCR反应体系为：模板菌液1 μL，2×Taq PCR StarMix 25 μL，引物NLSMFF(20 μmol/L)1 μL， 引物NLSMFR(20 μmol/L)1 μL，超纯水22 μL。反应程序如下： 94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s，72 ℃100 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性克隆。

1.2.3 质粒提取及鉴定:37 ℃恒温摇床摇菌10 h后按照《现代分子生物学实验技术》[10]中碱裂解法提取质粒。随后各取1 μL提好的质粒，与1 μL 6×核酸上样缓冲液及4 μL超纯水混合，进行琼脂糖凝胶电泳。当指示带位于琼脂糖凝胶的3/4处时，使用凝胶成像系统进行观察和拍照。

烟农主要通过参加烟草公司举办的培训及宣传来了解农药相关知识。调查统计有94.0%的烟农都参加过烟草公司组织的烟叶质量安全培训。在培训中，烟叶技术员主要对农药种类、安全间隔期、科学用药、绿色防控等方面进行了培训。烟农获得农药知识的另一渠道则来自销售人员的讲解及其与亲朋好友、邻居的交流。

1.2.4 农杆菌的转化与筛选:农杆菌的转化及所用试剂参考杨纪君等[10]方法。取表达载体pER35GFP.1、pER35GFP.2、pER35GFP-FMF、pER35FMF-GFP各1 μL分别加入到60 μL农杆菌感受态GV3101中，混合均匀后置于冰上3～5 min，进行电击转化。加入600 μL LB培养基(50 mg/L Kan，50 mg/Rif)，吸取到EP管中于28 ℃培养箱中培养2 h，取50 μL涂布于含有相应抗生素(50 mg/L Kan，50 mg/Rif)的平板上，于28 ℃培养箱中倒置培养30～40 h，对长出的菌落进行菌落PCR鉴定。

1.2.5 农杆菌侵染烟草叶片细胞和洋葱表皮细胞的瞬时表达:将 pER35GFP.1、pER35GFP.2、pER35GFP-FMF、pER35FMF-GFP，转化到GV3101农杆菌细胞中。将含表达载体的农杆菌转接于液体培养基，培养至对数生长期，离心收集菌体，加入浸润缓冲液[11]，重悬至OD600值约为 0.1～1.5，室温静置2～3 h后用于浸润。

采用农杆菌渗入法感染烟草叶片。用针头在植株叶片上扎2个孔，用无针头的针管注射叶片，依靠压力将菌液注入叶片的叶脉之间。通过农杆菌注射，大量的 T-DNA 转移到植物体内细胞核中，最后进行瞬时表达[12]。28 ℃条件下培养3 d，光照周期为 16 h光照/8 h黑暗。

无菌条件下取洋葱的鳞茎，将其切成若干个1 cm2的小块，用镊子剥取洋葱的表皮细胞，无菌水浸泡、滤纸吸干表面液体，平铺在1/2 MS固体培养基上。28 ℃暗培养24 h后，将预培养后的洋葱表皮在1.2.3获得的农杆菌液中浸泡 30 min，滤纸吸干表面的菌液，转入1/2 MS固体培养基中 25 ℃培养2 d，光照周期为16 h光照/8 h黑暗[13]。

1.2.6 GFP绿色荧光的观察:烟草叶片培养3 d后采集叶片，置于荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜(奥林巴斯FV1200)下，激发波长为480 nm，观察GFP的表达情况及亚细胞定位情况。

2 结果

2.1 定位表达载体的构建 对转化子pER35GFP.1和 pER35GFP.2(构建图谱见图1A、1B)进行菌落PCR，产物进行1%凝胶电泳，结果见图1C：分别在733 bp和758 bp处出现特异性扩增的条带，且符合目的片段大小。使用DNAMAN软件分析DNA测序结果，显示回收获得的733 bp、758 bp片段，与质粒S18GFP.1序列上GFP的序列一致性达100%。表明目的片段GFP均已成功插入载体。

图1 表达载体pER35GFP的构建A，B：植物表达载体pER35GFP.1和pER35GFP.2；C：重组质粒经 PCR鉴定的电泳结果。M：D2000 marker，A1-A3：重组质粒pER35GFP.1经PCR得到的733bp片段；B1：重组质粒pER35GFP.2经PCR得到的758bp片段；0：空载体Fig.1 Construction of expression vector pER35GFPA, B:Plant expression vector of pER35GFP.1 and pER35GFP.2 respectively; C: Agarose gel electrophoresis results of PCR for pER35GFP.1, pER35GFP.2. M:D2000 Marker;A1-A3: 733bp PCR fragments of amplified DNA from pER35GFP.1, B1:758bp PCR fragments of amplified DNA from pER35GFP. 1;0:Empty vector

2.2 融合FMF定位表达载体的构建 对转化子pER35GFP-FMF和pER35FMF-GFP进行菌落PCR，产物进行1%凝胶电泳检测，结果见图2。在1708 bp处有明显的特异性扩增的条带，且符合目的片段大小。表明目的片段成功插入到载体中。

图2 融合FMF定位表达载体鉴定M:D2000 marker；B:双蒸水；B0：空载体；B1-B3：pER35GFP-FMF转化子；B4-B6：pER35FMF-GFP转化子Fig.2 Bacterium liquid PCR results of fusion FMF localization expression vectorM:D2000 marker;B:ddH2O;B0:Empty vector;B1-B3: pER35GFP-FMF; B4-B6: pER35FMF-GFP

2.3 农杆菌侵染烟草叶片细胞和洋葱表皮细胞瞬时表达GFP结果 采集注射农杆菌pER35GFP.1、pER35GFP.2和pER35GFP-FMF、pER35FMF-GFP后瞬时表达3d的烟草叶片和洋葱表皮，置于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达(见图3A)。可在注射了农杆菌表达载体pER35GFP.1、pER35GFP.2的烟草叶片和洋葱表皮的细胞核与细胞膜周边观测到GFP荧光，而注射了农杆菌融合FMF定位表达载体的pER35GFP-FMF和pER35FMF-GFP烟草叶片和洋葱表皮，只在细胞核中观测到GFP荧光。表明在核定位信号的作用下，融合GFP定位的FMF蛋白已进入细胞核。只注射农杆菌GV3101的细胞没有观测到荧光。激光共聚焦显微镜观察结果显示(见图3B)，侵染含有表达载体农杆菌pER35GFP.1、pER35GFP.2的洋葱表皮细胞，在细胞质和细胞核中均能观测到绿色荧光，而在注射农杆菌融合FMF定位表达载体pER35GFP-FMF、pER35FMF-GFP的洋葱表皮细胞中，细胞壁无绿色荧光，仅细胞核中能观测到绿色荧光。只注射农杆菌GV3101的洋葱细胞没有观测到绿色荧光。

图3 烟草叶片细胞和洋葱表皮细胞的瞬时表达GFP结果A：荧光显微镜下结果；B：激光共聚焦显微镜下结果Fig.3 Results of transient expressing GFP in the leaves of Nicotiana benthamiana and onion epidermal cells A:Results under Fluorescence microscope;B:Results under laser confocal scanning microscopy

3 讨论

蛋白质科学研究将带动生物、医药、农业等相关产业的发展，由此催生的一系列新技术将引领未来生物经济。生命科学正迈入后基因组(或功能基因组学)时代，功能基因组学研究的重心将转向基因功能的鉴定，即由测定基因的DNA序列、解释生命的所有遗传信息转移到从分子及整体水平对生物学功能的研究上，在分子层面探索人类健康和疾病的奥秘。蛋白质基础研究将在分子、细胞、生命体的各个层面来揭示生命现象的本质[14]。目前蛋白质的亚细胞定位以及蛋白质浓度含量的测定已广泛运用于多种生物，但简单、高效和通用型的标签表达载体还比较缺乏。构建标签表达载体可极大地方便基因克隆和蛋白质定位等研究，目前已有各种标签短肽的检测试剂盒，因此开发通用型的标签载体，不仅可以定量检测目标蛋白表达，通过与GFP荧光进行对照观察，还能使蛋白质定量更为精确和直观。本文构建了通用型植物GFP标签蛋白表达载体，该载体可以运用于研究蛋白质在植物细胞中的亚细胞定位；同时可以通过对GFP蛋白的定量而得到研究的目的蛋白的含量。该技术具有以下几个优点：

① 设计操作相对简便。传统方法在研究蛋白质定位时，需要通过DNA重组技术得到目的基因与标记基因重组后的表达产物，在构建多片段DNA插入的载体时，每插入一个片段就需要一次连接、转化及阳性克隆鉴定，操作步骤繁琐，通常要构建多个中间载体，要经多次连接、转化，增加了重组体鉴定时的工作量，费时又费力。而使用通用型植物GFP标签蛋白表达载体只需要针对目的基因设计一对引物并且引物两端设计留有BglII位点，即可通过一步连接而构建好融合GFP标签蛋白的表达载体。之前的研究表明，不同的目的蛋白其核定位信息可能在N端也可能在C端，甚至两端都有[15]，因此如果仅将荧光蛋白融合在目的基因一端，很可能导致信号肽无法被识别[16]。本载体系统在研究目的蛋白N端和C端分别融合GFP基因，构建了2个亚细胞定位载体，使用者可以根据研究目的蛋白的具体情况进行选择。

② 标记基因容易观察、成本低廉。通用型植物GFP标签蛋白表达载体使用GFP作为标记基因，在荧光显微镜下即可观察，能够清楚的观察到被研究蛋白的位置情况，相较于其他定位方法，如免疫胶体金标记、免疫荧光等，使用成本低廉。

③ 能够定量研究蛋白质的表达量。目前GFP绿色荧光蛋白定量试剂盒已广泛应用。可以通过对GFP表达量的测定而得到被研究蛋白的表达情况。

本文利用通用型植物GFP标签蛋白表达载体研究蛋白质的细胞内定位。实验设计简便，简化了大量的实验步骤。实验材料可以通过荧光显微镜直接观察，成本低廉具有很高的性价比。并且能够通过GFP绿色荧光蛋白定量试剂盒来定量研究蛋白的表达。本套载体的构建为研究植物中蛋白质亚细胞定位及定量提供了一个很好的基因克隆工具。

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(编校：吴茜)

Universal expression vector with GFP label protein was used to study protein localization in plant cell

MENG Xiang-chao1, LIU Guo-fu1, LIU Ying2, BAO Yue2, CAO Xue-song1Δ

(College of Life Science, Liaocheng University, Liaocheng 252000, China)

ObjectiveTo explore the application of universal expression vector with GFP label protein, study the meaning of protein localization in plant cell in the field of proteomics and metabolomics.MethodsTwo sets of GFP tagged protein expression plasmids,in which the N and C terminals of GFP fragments contained multiple cloning sites for inserting genes of interesting were constructed in this study. By utilizing these constructs, we cloned endonuclease FokI cleavage domain fused with MS2 bacteriophage coat protein (MCP) forming fusion protein FokI:MCP:FokI(FMF), in which the cellular nuclear localization signals(NLS) were linked to N and C terminals of GFP respectively. The expression of cloned genes are expected to create fusion proteins of GFP:FMF and FMF:GFP respectively. The resulting constructs were transformed into agro-bacterium and transiently expressed both in the cells of Nicotiana benthamiana and onion leaf epidermic cells via agrobactereal infiltration.ResultsTwo expression vector with GFP and target protein were constructed successfully. The observation under confocal microscope showed that the GFP protein localizes both in nuclear and cytoplasm and NLS:GFP:FMF and FMF:GFP:NLS only in the nuclear.ConclusionThese constructs can be utilized for studying protein subcellular localization in plant cells, which is easy to use, high efficiency and versatile.

subcellular localization; plant expression vector; transient expression

国家自然科学基金(31370387)

孟祥潮，男，硕士，研究方向：植物分子与病毒，E-mail: 745851140@qq.com；曹雪松，通信作者，男，博士，教授，研究方向：植物分子生物学，E-mail:caoxuesong@lcu.edu.cn。

Q944

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.08