抑制ERK1/2通路对卡铂诱导人卵巢癌细胞凋亡的影响*

齐齐哈尔医学院附属第三医院妇产科(齐齐哈尔161001)　李兴媚　郑立红　刘　丹▲　李跃文　梅庆步　董　冰



抑制ERK1/2通路对卡铂诱导人卵巢癌细胞凋亡的影响*

齐齐哈尔医学院附属第三医院妇产科(齐齐哈尔161001)李兴媚郑立红△刘丹△▲李跃文梅庆步△董冰

摘要目的：探讨抑制ERK1/2通路对卡铂诱导卵巢癌细胞凋亡作用的影响。方法：采用Hoechst 33258荧光染色法检测抑制ERK1/2通路对卡铂诱导卵巢癌HO-8910细胞凋亡的影响；用分光光度法检测卡铂浓度的增加及抑制ERK1/2通路对卵巢癌HO-8910细胞Caspase-8和Caspase-9活化的影响。结果：CBP组、PD98059组及联用组部分细胞核呈现亮蓝色荧光的为凋亡细胞，细胞核可见碎块状荧光信号，凋亡指数CBP组为20.35%，PD98059组为15.21%，联用组为29.78%。随着卡铂浓度的增加，Caspase-8、Caspase-9活性的改变并不明显(P>0.05)，而联用组的Caspase-8、Caspase-9活性最高，抑制ERK1/2通路可促进卡铂增强Caspase-8、Caspase-9的活性(P<0.01)。结论：抑制ERK1/2通路可促进卡铂诱导卵巢癌细胞凋亡作用，并与Caspase-8、Caspase-9活化有关。

主题词卵巢肿瘤/化学诱导卵巢肿瘤/预防和控制卡铂/治疗应用有丝分裂素激活蛋白激酶类/代谢半胱氨酸内肽酶类/代谢

卵巢癌是女性常见恶性肿瘤之一，因其发病隐匿，患病早期很难发现，所以预后不良。目前针对卵巢癌的治疗手段主要是手术及以铂类为基础的化疗相结合，然而卵巢癌的复发率和耐药率较高，这严重制约患者的预后。卡铂(Carboplatin, CBP)是第二代铂类化合物，为广谱抗肿瘤药，在预防卵巢癌术后复发转移中显示出良好的应用前景。细胞外信号调节激酶(Extracellular signal regulated protein kinase, ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase, MAPK)的重要成员之一[1]，它也是组成从细胞膜到细胞核的细胞信号系统之一，可以调控细胞增殖及细胞凋亡[2]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)活化是导致细胞凋亡的中心事件，Caspase-8和Caspase-9作为凋亡始动子，位于级联反应的上游，活化后可激活下游的Caspase，使细胞发生细胞凋亡的生化及形态学改变[3]。进一步加强对卡铂的研究，明确ERK1/2通路与肿瘤细胞凋亡的关系，探索其具潜能的肿瘤治疗靶点。课题组前期研究结果显示：卡铂通过抑制ERK1/2激活，增强其抗卵巢癌细胞增殖作用[4]。本研究探讨抑制ERK1/2通路对卡铂诱导卵巢癌细胞凋亡作用的影响。

材料与方法

1实验材料细胞系为卵巢癌HO-8910细胞，由哈尔滨医科大学遗传学研究室提供。卡铂注射液购自齐鲁制药(海南)有限公司，规格10ml: 50mg；PD98059为美国Promega产品，规格5mg；优级胎牛血清购自美国Hyclone公司，规格100ml；胰蛋白酶购自美国Amresco公司，规格25g；RPMI-1640 培养基购自美国Gibco公司，规格10×11；Hoechst 33258细胞凋亡荧光试剂盒(规格100 assays)、分光光度法检测Caspase-8及Caspase-9试剂盒(规格20assays)购自南京凯基生物科技发展有限公司。

2实验方法

2.1卵巢癌HO-8910细胞的体外培养：细胞接种于含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃、体积分数为5% CO2和90% 相对湿度的培养箱中培养，每24h换液1次，待细胞铺满瓶底约80%～90%后，用胰蛋白酶消化，以1∶2的比例分瓶传代，进行实验的细胞均取对数生长期。

2.2Hoechst 33258荧光染色法观察卵巢癌细胞凋亡：设4个实验组，分别为空白对照组、20μmol/L CBP组、50μmol/L PD98059(ERK1/2抑制剂)组、50μmol/L PD98059和20μmol/L CBP的联用组，联用组先用50μmol/L PD98059作用1h后，再加入20μmol/L CBP。细胞以1×105个/孔浓度接种于24孔板，每个实验组设3个平行孔，培养24h后，加入上述4组不同的培养液0.5ml，继续培养24h后，用冷Buffer A洗涤细胞2次，加入1ml 的4%甲醛溶液，4℃固定细胞10min，再用Buffer A洗涤细胞2次，最后滴加Hoechst 33258工作液100μl，室温下染色10min，以紫外光340nm波长激发，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况，实验重复3次，并计算凋亡指数AI(%)，即：随机计数1000个细胞，计算具备显著凋亡特征的细胞核数量所占的百分比。

2.3检测Caspase-8、Caspase-9活性：设6个实验组，分别为空白对照组、10μmol/L 的CBP组、20μmol/L 的CBP组、40μmol/L 的CBP组、50μmol/L的PD98059组、50μmol/L PD98059和20μmol/LCBP的联用组。①抽提蛋白，细胞以3×105个/孔浓度接种在6孔板中，每个实验组设3个平行孔，培养24h后，加入上述不同浓度梯度的CBP培养液2ml，培养24h后，收集细胞，PBS液洗涤两次，冰上加入蛋白抽提试剂200μl，小心吹打均匀，裂解40min，4℃ 10,000 rpm 离心2min，小心转移上清液，并记录各实验组转移上清液的体积。②蛋白定量，先将BSA标准品和待测蛋白样品稀释10倍，各取25μl加入96孔板，每个实验组设3个平行孔，然后加入BCA工作液200μl混匀，再于37℃避光孵育30min，待冷却至室温时，在自动酶标仪中检测570nm波长时的吸光度值，根据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度，用裂解液调整样品蛋白浓度一致为2μg/μl。③检测Caspase-8、Caspase-9活性，取50μl (100μg)的细胞裂解上清，加入50μl 2×Reaction Buffer(使用前每50μl 2×Reaction Buffer加入5μl DTT)，再加入5μl Caspase-8或Caspase-9 Substrate，于37℃避光孵育4h，最后用酶标仪检测405nm的吸光度值，用药物组与对照组的吸光度比值来表示各药物组Caspase-8、Caspase-9的活化程度。

结果

1Caspase-8、Caspase-9活性检测结果所有实验组之间的Caspase-8、Caspase-9活性变化有显著性差异(Caspase-8P<0.05；Caspase-9F=17.778，P<0.01)，但随着卡铂浓度的增加Caspase-8、Caspase-9活性改变并不明显(P>0.05)，而联用组的Caspase-8、Caspase-9活性最高，抑制ERK1/2通路可促进卡铂增加Caspase-8、Caspase-9活性(P<0.01)，详见附表。

附表　24h CBP、PD98059单用及联用对Caspase-8、Caspase-9活性的影响

注：与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01；与联用组比较, #P<0.05, ##P<0.01

2Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡情况CBP组、PD98059组及联用组部分细胞核呈现亮蓝色荧光的为凋亡细胞，细胞核可见碎块状荧光信号，而对照组细胞呈现均匀的暗蓝色荧光(见附图)；凋亡指数结果，CBP组为20.35%，PD98059组为15.21%，联用组为29.78%。

附图荧光显微镜下CBP、PD98059单用及联用诱导HO-8910细胞凋亡的形态学变化(×200；A：对照组； B：CBP组； C：PD98059组； D：PD98059+CBP组)

讨论

在触发细胞凋亡的信号途径中，Caspase家族蛋白酶发挥重要作用。一般情况下，Caspase以无活性的形式存在于细胞中，在受到内外因素的作用下，产生凋亡信号，传至Caspase，引起其活化，Caspase-2、8、9、10等位于级联反应的上游，活化后激活下游的Caspase-3、6、7，最终导致细胞发生凋亡，其中Caspase-3起关键作用[5]。而ERK1/2通路与Caspase家族之间的关系又是怎样的呢。咖啡酸苯乙酯(天然药物)能降低人结肠癌HT-29细胞ERK的mRNA和蛋白表达，增加Caspase-3的mRNA表达[6]。凝血因子Ⅶa依赖组织因子活化蛋白酶激活受体2，通过ERK1/2途径，下调结肠癌SW620细胞Caspase-3表达，从而促进结肠癌细胞增殖[7]。抑制ERK1/2通路活化在抗卵巢癌研究中，取得了一定的成果。抑制ERK1/2可提高卵巢癌HO-8910细胞的对化疗药物的敏感性[8]。作者在研究ERK1/2通路对卡铂诱导人卵巢癌HO-8910细胞周期阻滞的影响时，发现卡铂抑制卵巢癌HO-8910细胞生长，阻滞其细胞周期进程与过度活化ERK1/2有关，应用MEK1/2特异性抑制剂PD98059抑制ERK1/2活化，卡铂的抗增殖作用增强，诱导人卵巢癌HO-8910细胞S期和G1期阻滞[1]。本研究结果显示：抑制ERK1/2通路可促进卡铂诱导卵巢癌细胞凋亡作用，并与Caspase-8、Caspase-9活化有关。卡铂还可增加卵巢癌HO-8910和OVCAR3细胞凋亡率，并与EphA2蛋白表达降低有关[9]。卡铂可通过激活ERK1/2通路而诱导卵巢癌OVCA429细胞凋亡[10]。抑制ERK1/2信号通路的激活可明显抑制卵巢癌细胞生长[11]。PD98059作为ERK1/2通路抑制剂，可以下调磷酸化ERK1/2的表达，从而抗卵巢癌SKOV3细胞增殖；PD98059与顺铂联用可使SKOV3细胞的凋亡率明显增加，增强顺铂的抗癌作用，提示抑制ERK1/2通路可提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性[12]。

值得注意的是：在本研究结果中随着卡铂浓度的增加，Caspase-8、Caspase-9活性改变并不明显，与卡铂抗细胞卵巢癌增殖作用随其浓度的增加而增强[4]并不一致；联用组的Caspase-8、Caspase-9活性最高，抑制ERK1/2通路可明显促进卡铂增加Caspase-8、Caspase-9活性，提示卡铂通过活化Caspase-8和Caspase-9调控细胞凋亡与ERK1/2通路关系密切。另外，荧光染色法显示卡铂(20μmol/l)能诱导卵巢癌细胞发生明显的细胞凋亡的形态学改变，但其Caspase-8、Caspase-9活性未同步增强，提示卡铂诱导卵巢癌HO-8910细胞凋亡可能与激活Caspase家族中其他凋亡始动子有关，其机制有待于进一步研究。

铂类化疗药物通过激活或抑制ERK1/2通路而抑制卵巢癌细胞增殖，抑制ERK1/2激活又可进一步增强铂类化疗药物的抗肿瘤作用，临床上防治卵巢癌的复发转移可以考虑联合应用ERK1/2通路特异性抑制剂，提高肿瘤对铂类化疗药物的敏感性，减少其剂量，降低其毒副作用及耐药性的发生。

参考文献

[1]陈誉华. 医学细胞生物学[M].第5版. 北京: 人民卫生出版社, 2013：290-291.

[2]Park J, Song KH, Ha H. Fractalkine increases mesangial cell proliferation through reactive oxygen species and mitogen-activated protein kinases[J]. Transplant Proc, 2012, 44(4):1026-1028.

[3]赵瑞杰, 李引乾, 王会, 等. Caspase 家族与细胞凋亡的关系[J]. 中国畜牧杂志, 2010, 46(17): 73-78.

[4]刘丹, 郑立红, 李兴媚. 卡铂通过抑制ERK1/2通路诱导人卵巢癌细胞S和G1期阻滞[J].中国生物化学与分子生物学报,2014,30(8):815-823.

[5]Joseph EK, LevineJD. Caspase signalling in neuropathic and inflammatory pain in the rat [J]. Eur J Neurosci,2004,20(11):2896- 2902.

[6]梁路昌,王军,张艳敏,等.咖啡酸苯乙酯对HT-29细胞FAK、ERK及Caspase-3表达的影响[J].肿瘤药学,2015,5(4):262-266.

[7]张先梅,周红,陈东东,等.因子Ⅶa 依赖组织因子激活PAR2/ERK/NF-κB 抑制结肠癌SW620 细胞Caspase-3表达[J].临床检验杂志,2012,30(4):284-288.

[8]Chen P,Pang X,Zhang Y,etal. Effect of inhibition of the adrenomedullin gene on the growth and chemosensitivity of ovarian cancer cells[J].Oncol Rep，2012，27(5): 1461-1466.

[9]郭健,陈颖.达沙替尼联合卡铂对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响[J].中国妇幼保健, 2011,26(24):3784-3787.

[10]Gupta N,Xu Z,El-Sehemy A,etal. Notch3 induces epithelial-mesenchymal transition and attenuates carboplatin-induced apoptosis in ovarian cancer cells[J].Gynecol Oncol,2013,130(1):200-206.

[11]Suga S,Kato K,Ohgami T,etal.An inhibitory effect on cell proliferation by blockage of the MAPK/estrogen receptor/MDM2signal pathway in gynecologic cancer[J].Gynecol Oncol,2007,105(2):341-350.

[12]贾宗洋,张向宁,靳艳慧,等. PD98059联合顺铂对卵巢癌细胞增殖的影响[J].山东大学学报:医学版,2013,51(2):27-32.

(收稿：2015-12-10)

通讯作者▲

【中图分类号】R737.31

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.05.004

Effects of carboplatin inducing apoptosis in human ovarian cancer cells through inhibiting ERK1/2 pathway

Department of Obstetrics and Gynecology, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University (Qiqihar 161001)Li XingmeiZheng LihongLiu Dan et al

ABSTRACTObjective：To explore the impacts of cell apoptosis treated by carboplatin in ovarian cancer cells through inhibiting ERK1/2 pathway. Methods： Hoechst 33258 assay was used to detect the effects of carboplatin inducing apoptosis in human ovarian cancer HO-8910 Cells through inhibiting ERK1/2 pathway. Spectrophotometry was used to detect the impacts of activation of Caspase-8 and Caspase-9 through increasing the concentration of carboplatin and inhibiting ERK1/2 pathway. Results： The nucleus of all drug groups appeared bright blue fluorescence, they were apoptotic cells. Some nuclei had fragmental fluorescence. Apoptosis index, CBP group was 20.35%, PD98059 group was 15.21%, combined group was 29.78%. The activities of Caspase-8 and Caspase-9 changed were not obvious, with increasing concentrations of carboplatin (P>0.05). And combined group's activities were the highest. Inhibition of ERK1/2 pathway could help carboplatin increasing Caspase-8 and Caspase-9 (P<0.01). Conclusion： Inhibition of ERK1/2 pathway can promote carboplatin inducing cell apoptosis in human ovarian cancer cells, and it relates to caspase-8 and caspase-9 activations.

KEY WORDSOvarian neoplasms/chemically induced Ovarian neoplasms/prevention and control Carboplatin/therapeutic use Mitogen-activated protein kinase kinases/metabolism Cysteine endopeptidases/metabolism

*黑龙江省卫生计生委科学技术研究项目(2013173)

△齐齐哈尔医学院基础医学院生物遗传教研室