外周血miR-21检测在胰腺癌中的意义研究进展

刘书中,李子全,李政垚,王以朋

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 骨科,北京100730)



外周血miR-21检测在胰腺癌中的意义研究进展

刘书中,李子全,李政垚,王以朋*

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 骨科,北京100730)

胰腺癌(pancreaticcarcinoma，PC)是消化系统中恶性程度最高、预后最差的恶性肿瘤之一，95%的胰腺癌为胰腺导管腺癌(pancreaticductuleadenocarcinoma，PDAC)，其发病率有不断上升趋势。PC在肿瘤致死原因中列第四位，是5年生存率最低的恶性肿瘤，而缺乏早期诊断手段、早期易出现远处转移和发生化疗耐药是导致胰腺癌高死亡率的主要原因。胰腺癌早期诊断率低，致使95%以上的胰腺癌患者在明确诊断时己进入进展期，约60%患者获诊时已是IV期病例，病死率高达99%。手术是根治胰腺癌的唯一方法，但可施行根治性手术患者仅占15-20%，并且约70%患者在接受手术治疗后的6-12个月复发。[1]。化疗是胰腺癌主要的辅助治疗手段，然而肿瘤细胞对化疗药物产生的耐药性严重地影响了胰腺癌化学治疗疗效。目前，CA19-9与CEA是最常用的胰腺癌分子诊断标志物，但正常人胰腺、胆管、胆囊、胃、乳腺和子宫内膜等组织发生病变时CA19-9及CEA分泌亦会增加，且易出现假阳性及假阴性，早期诊断胰腺癌的效能则更低。近年来，提高PC高危人群早期筛查确诊率、增强癌变组织药敏性及改善PC患者生存质量已成为PC研究中的热点及难点。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类在真核生物中发现的长18-25个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA。研究表明miRNA的异常表达与肿瘤的发生、分级分期、耐药性、预后等密切相关，参与了肿瘤细胞重要的细胞生物学行为的调控,间接地发挥“促癌和抑癌”等功能，miRNAs的深入研究为多种恶性肿瘤的诊断和治疗提供了新思路。研究表明外周血miR-21水平与胰腺癌的病情进展密切相关，有望成为胰腺癌诊断及预后判断的生物学标记物及治疗靶标[2]。鉴于miR-21与胰腺癌的相关性逐渐被发现并证实，本文就近年外周血miR-21水平在胰腺癌诊疗及预后评估领域的研究进展做一综述。

1miRNA的分子生物学特征

miRNA生成过程中,编码miRNA的基因首先在细胞核内转录,在RNA聚合酶II的作用下转录为几百至几千碱基的初级产物(pri-miRNA),pri-miRNA在核内核酸内切酶Drosha酶作用下切割成只含60-70碱基的具有茎-环结构的发夹样前体(pre-miRNA),pre-miRNA被RNAGTP2依赖的转运体exportins5转运至胞浆,在IIIDicer酶(双链RNA专一性内切酶)作用下形成具有双链结构的miRNA,在酶的作用下裂解成22个核苷酸的成熟miRNA与互补链miRNA*。而miRNA*立即被降解。

miRNA的主要分子生物学特征包括:(1)通常长度为18-25nt,3’端可以有2-3个nt的变化,长度不定。(2)广泛存在于真核生物中,不具有开放阅读框架(ORF,openreadframe),不编码蛋白质。(3)成熟后的miRNA5’端为磷酸基团,3’端是羟基基团,这一特点可以使miRNA与功能性RNA降解生成片段相区分，miRNA通过与靶基因mRNA3’-UTR完全或不完全的互补配对结合,致使靶mRNA降解或翻译抑制进而调控靶基因的表达,从而影响细胞增殖、侵袭、分化和凋亡等多种生物学行为。(4)miRNA在多种种属中的表达具有保守性。(5)miRNA的表达具有时序性和组织特异性。miRNA的保守性、时序表达特异性和组织表达特异性提示其在生命活动的微观层面发挥重要作用[3]。

miRNA的功能由RNA所介导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)介导,最终引起蛋白质翻译受抑或者同源mRNA降解等生物过程，进而发挥抑癌基因或促癌基因的功能[4]。大量研究显示miRNA可调节人类近60%的蛋白编码基因,miRNA与靶mRNA并非完全互补配对,平均每个miRNA可以直接调节人类200种不同的mRNA,多个miRNA可以协同调节某些特殊靶基因,多个miRNAs也可能共同调节同一基因靶点,这种协同调节模式形成复杂的调控网络，因此每一个miRNA的异常表达都有可能导致大量蛋白质的表达异常[5,6]。

2miR-21与胰腺癌的关系

50%以上的miRNAs基因位于染色体脆性位点及染色体扩增、缺失或转位区域，因而miRNAs表达异常易导致肿瘤性疾病的发生。miR-21编码基因位于第17号染色体,其成熟序列长度为21bp。miR-21可调控肿瘤细胞增殖、侵袭、转移和凋亡等多种生物学行为。研究证实miR-21在胰腺癌、食管癌、肺癌以及结肠癌等恶性肿瘤组织中均出现异常高表达，并发现miR-21在多种恶性肿瘤中通过抑制PTEN(phosphataseandtensinhomolog)、程序性细胞死亡因子4(programmedcelldeath4，PDCD4)、金属蛋白酶3组织抑制因子(tissueinhibitorofmetalloproteinases-3，TIMP3)、TPM1 (tropomyosin1)和maspin等细胞凋亡相关基因促进肿瘤细胞增殖、浸润及发生化疗耐药[7]。Moriyama等[8]研究发现miR-21在胰腺癌组织和细胞株中均呈显著高表达，转染miR-21前体可以明显增加胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力，而抑制miR-21则明显抑制其增殖与侵袭，同时发现miR-21与侵袭相关基因MMP-2、MMP-9和VEGF的表达呈正相关，进而增强胰腺癌细胞侵袭能力，并证实miR-21与胰腺癌化疗耐药相关，提示miR-21有望成为耐化疗胰腺癌患者新的治疗靶点。miR-21通过抑制某些基因的表达、激活蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB)信号通路等方式激活核因子-κB(nuclearfactorkappaB，NF-κB)信号通路，NF-κB通路的激活能上调VEGF蛋白及IL-6等表达，最终增强PC细胞浸润及转移能力。Park等[9]研究表明miR-21和miR-221的过度表达增强了胰腺癌细胞的恶性表型，在HS766T细胞系中应用反义寡核苷酸敲除miR-21和miR-221的表达，可使肿瘤细胞在G1期生长受阻，减少细胞增殖，促进细胞凋亡。此外，脂质体转染上调miR-21表达可使其靶基因Bcl-2表达过量，间接导致caspase-3蛋白活性下降而使细胞凋亡减少，下调miR-21表达则使caspase-3蛋白活性增加而导致离体PC细胞凋亡增多。有研究发现PDAC细胞株(MiaPaCa-2)中let-7和miR-143的缺失以及miR-21高表达会上调Ras及其GTP激酶，从而促进肿瘤增生，而姜黄素类似物CDF可以促进let-7和miR-143重新表达以及miR-21表达下调，从而抑制肿瘤增生，因此，CDF可能成为新的胰腺癌治疗药物[10]。原位杂交显示miR-21是由病理性导管细胞产生，在胰腺导管腺癌组织中获得的，胰腺癌细胞系中miR-21的产生受Kras(G21D)和表皮生长因子受体调节，DuRieu等[11]应用Kras(G12D)小鼠模型和实时定量PCR技术研究miRNA在PanIN中的表达情况,研究发现miR-21、miR-205及miR-200与PanIN的发展相关，其中miR-21的相关性最大，而且miR-205和miR-21的表达上调先于表型的改变。miR-21、miR-221、miR-222及let-7a随着PanIN分级增高而表达上调，其高峰在PanIN2/ 3，此研究提示miR-21具备成为检测早期胰腺癌分子标志物的潜能。Zhang等[12]利用古抑菌素A(TSA)处理胰腺癌细胞后，观察到细胞生长停滞在G0/G1 期、细胞凋亡率增加、胰腺癌细胞中miR-21表达下调，该研究表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂也可以通过调控miR-21发挥治疗胰腺癌的作用。miR-21在胰腺癌中的差异性表达肯定了它在胰腺癌诊断、治疗及预后中的重要作用，但是其具体作用机制尚不明确。miR-21可以作用于靶基因，而靶基因又可以调节miR-21的表达，所以miR-21不会是点对点式的在肿瘤的进展中起作用，而是在肿瘤细胞中形成复杂的调控网络。因此，进一步阐明miR-21在胰腺癌中的作用及机制将为胰腺癌临床诊疗提供更优化的措施。

3外周血miR-21检测在胰腺癌诊断、治疗及预后评估中的意义

3.1外周血miRNA的表达及检测方法

外周血miRNA可能来源于凋亡坏死肿瘤细胞、血细胞、巨噬细胞的裂解等。最新研究显示血清miRNA可能来自组织细胞的主动分泌过程，成熟的miRNA在细胞内被脂蛋白包被成外切酶体分泌至细胞外，最终到达血液。由于大多数miRNA是由细胞分泌的，组织细胞中miRNA与循环miRNA必然有一定的联系。研究结果表明miRNA在组织和体液中具有相同的改变趋势[13]。但胰腺肿瘤组织检测技术难度高，对机体创伤大，在获取组织或者细胞的过程中也容易受到周围组织或细胞的污染，从而降低有效诊断率。实验表明外周血中RNA在室温下过夜、反复冻存、解冻、煮沸、过酸或过碱等恶劣情况下可以维持稳定，进一步证实了循环miRNA替代组织活检而成为新型生化指标的可能。

目前检测miRNA的方法有克隆测序、Northern印记杂交、原位杂交、基因芯片、实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)等[14]。其中应用最广泛的是qRT-PCR技术，能区分miRNA前体和成熟体，只定量具有生物活性的成熟miRNA，可精确区分同一家族中序列高度同源的miRNA，能检测只有一个碱基差别的不同miRNAs表达水平，灵敏度和特异度高，样品消耗量少，只需要l-l0ngRNA即能检测出低丰度靶miRNA，定量线性范围宽，有着在临床检测领域大规模推广的潜力。

3.2外周血中miR-21检测在胰腺癌诊断、治疗及预后评估中的价值

Kong[15]和Que等[16]研究证实外周血miR-21可以将胰腺癌患者与健康对照者相鉴别。krha等[17]在对胰腺癌合并糖尿病患者血清肿瘤标志物的研究中发现miR-21可作为胰腺癌诊断的新型生化指标，但对于新发无症状的胰腺癌合并糖尿病患者中miR-21对疾病的预后价值尚需进行深入研究。Ali等[18]选取50例胰腺癌患者血浆行miRNA分析，发现miR-21的表达显著升高，同时还发现化疗耐药的胰腺癌细胞株中，miR-21明显高表达，与血浆中miR-21结果一致，提示血浆miR-21表达水平可作为肿瘤侵袭的潜在生物指标，有望用于高危患者的筛查以及胰腺癌化学治疗新的靶点。

Hwang[19]和Frampton等[20]研究证实miR-21高表达的胰腺癌患者预后更差，可能与吉西他滨的耐药性有关，高表达miR-21的患者术后生存率明显降低。Bhatti[21]和Liu等[22]发现胰腺癌患者血清中miR-21为高表达，并且其水平与疾病分期有关，可有效区分胰腺癌的不同阶段，并且具有较高的灵敏性和特异性。Abue等[23]应用定量RT-PCR方法检测32例PDAC患者、12例胰腺导管内乳头状黏液瘤(intraductalpapillarymucinousneoplasm,IPMN)患者及30位健康对照者血浆样本中miR-21和miR-483-3p表达水平。结果显示PDAC患者血浆中miR-21和miR-483-3p水平相对健康对照组显著升高(P<0.01)。血浆miR-21水平与PDAC患者疾病分期(P<0.05)、肝脏及淋巴结转移(P<0.01)和短生存期(P<0.01)密切相关，因而血浆miR-21水平具有预测PDAC预后的潜能。Ren等[24]在对1例胰腺癌肝脏及胸腔转移合并胸腔积液的诊治中，检测患者血浆miR-21水平为正常人群的8.3倍，并认为胰腺癌患者血浆miR-21水平升高是提示肝脏转移的有效预测指标，联合检测血浆miR-21水平和CA19-9对诊断胰腺癌具有重要临床价值。

3.3外周血中miR-21与胰腺癌化学治疗药物敏感性/耐药性评估

目前，已研发的肿瘤化疗药物在肺癌、乳腺癌、胃癌等实体肿瘤的临床研究中显示出明确的疗效，而对胰腺癌患者疗效却受到限制，这与胰腺癌细胞对相关化学治疗药物耐药性增强密不可分。因此，明确胰腺癌化疗耐药机制、寻找耐药相关基因作为指导个体化治疗的标记物和潜在治疗靶点是扭转化疗耐药、提高治疗效果并改善胰腺癌预后的关键，多项研究显示外周血miR-21水平与胰腺癌化学治疗药物敏感性/耐药性密切相关。

Park等[9]应用反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotides,ASO)治疗胰腺癌并观察miR-21和miR-221的生物学功能，发现miR-21及miR-221的ASO干预能增加肿瘤细胞化疗敏感性。Hwang[19]和Song等[25]在临床中发现低表达miR-21的患者对吉西他滨化疗更加敏感，而进一步体外实验表明转染抗miR-21可以增加肿瘤组织对化疗药物的敏感度。Wang等[26]选择177例以吉西他滨为主的胰腺癌化疗患者的血清miR-21进行研究，证明血清miR-21高表达与肿瘤进展快、肿瘤进展时间短和总生存期短相关，血清miR-21水平是预测胰腺癌进程和总生存期的独立因素。功能分析提示吉西他滨化疗降低了miR-21的表达水平，上调了Fas配体(FasLigand，FasL) 的表达，吉西他滨化疗后FasL的表达上调诱导了胰腺癌细胞凋亡，而miR-21可保护胰腺癌细胞免受吉西他滨化疗诱导的凋亡，且FasL是miR-21的直接靶标，研究表明血清miR-21水平可以预测进展期胰腺癌的化疗疗效并发现了miR-21作用于FasL/Fas途径介导的化疗耐药新机制。Passadouro等[27]研究证实小剂量化疗药物舒尼替尼联合miR-21沉默可以大幅增加抗肿瘤疗效，对于PDAC的治疗具有良好的应用价值。

3.4外周血miR-21与其他生化指标联合检测

将一种或多种外周血miRNA与其他类型肿瘤标志物进行联合检测，可有望显著提高诊断的准确性。Kong等[15]检测49例PDAC患者和36例正常人外周血标本中miR-21、miR-210、miR-155和miR-196a作为PDAC血清标志物的可能性，发现此4种miRNA在PDAC患者血浆中含量明显增多，单独作为诊断标志物的诊断效能分别为0.62、0.65、0.67和0.69，并且4种miRNA联合诊断的效能为0.82，敏感性和特异性分别为64%和89%，提示多个miRNA联合诊断比单个miRNA的诊断效能明显提高。最新研究发现联合检测血清中7种miRNAs(miR-20a、miR-21、miR-24、miR-25、miR-99a、miR-185及miR-191)鉴别胰腺癌患者和健康对照者的准确率为86.8 %，明显高于CA19-9(76.0 %)和CEA(55.8 %)；对怀疑为胰腺癌的55例患者的血清中的7种miRNA进行检测与病理诊断后的准确性进行比较，发现联合这7种miRNA作为标志物检测准确率可达83.6 %(26例I期胰腺癌患者联合诊断率为96.2%，48例II期胰腺癌患者联合诊断率91.7%)，而CA19-9和CEA的准确性分别为56.4%和36.4%[28]。

4结语及展望

外周血与组织中多种miRNAs在胰腺癌中均有异常表达，并且其水平随着胰腺癌病情进展而相应改变。研究表明外周血与组织中miR-21水平可作为胰腺癌诊断、病情进展、化疗药物敏感性/耐药性预测及预后评估的新型生化指标，并有望为胰腺癌的治疗提供新的靶点。

近年来，针对miRNA的研究已成为国际上热点研究内容之一，对外周血与组织中miRNA的研究也逐渐开展，但目前miRNA的临床相关研究还缺乏大样本、多中心的数据论证，缺乏统一的检测方法及严格的质控标准。由于miRNA作用的多重性，使有关外周血与组织中miRNA的研究方向得以不断扩展。但其特异性作用机制等尚需进一步探讨，以期早日应用于临床。随着研究内容不断深入，外周血miRNAs检测将在胰腺癌的早期诊断、鉴别诊断、化学治疗效果及预后判断等诸多方面展现出更为广泛的应用价值，并且对胰腺癌的诊断、治疗及预后评估起到推动作用。

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*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)06-1038-05

(收稿日期：2015-11-24)