铜绿假单胞菌整合子系统与多重耐药关系的探讨

肖晓光,李艳莲，孙国华

(大连医科大学附属第一医院 检验科,辽宁 大连116011)



铜绿假单胞菌整合子系统与多重耐药关系的探讨

肖晓光,李艳莲，孙国华*

(大连医科大学附属第一医院 检验科,辽宁 大连116011)

摘要：目的检测多重耐药的铜绿假单胞菌中整合子系统的分布和耐药基因携带情况，并探讨整合子系统的分布与多重耐药的关系。方法选取2012年5月至2012年10月由大连医科大学附属第一医院住院患者各种标本中分离的多重耐药的铜绿假单胞菌148株，提取全基因组DNA，通过PCR方法扩增Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子和相关耐药基因bla CTX-M、bla SHV、bla VIM、bla IMP、OPrD2、aadA、aadB，并通过凝胶电泳方法对扩增结果进行分析。结果在多重耐药的铜绿假单胞菌中I类整合子阳性检出率为 56.1% (83/148)；未检测到Ⅱ、Ⅲ类整合子；在整合子阳性的多重耐药的铜绿假单胞菌中，耐药基因blaVIM、blaSHV、blaIMP、aadA、aadB检出率分别为39.8%、28.9%、25.3%、31.3%和27.7%，和整合子阴性的多重耐药的铜绿假单胞菌比较均存在显著性差异(P<0.05)。结论整合子系统在多重耐药的非发酵菌属的铜绿假单胞菌中检出率很高，它的存在是铜绿假单胞菌产生多重耐药的一个重要因素。

关键词：多重耐药；整合子；铜绿假单胞菌；耐药基因

(Chin J Lab Diagn,2016,20:0966)

多重耐药菌定义为一种微生物对三类或三类以上抗生素同时耐药。抗生素的广泛和不限制应用，导致细菌的多重耐药性问题日益严重[1]。近年来，该问题已逐步引起了全球范围的关注，耐药菌株的快速出现与细菌抗生素耐药基因的获得和播散密切相关。目前研究发现，细菌产生耐药性的主要方式为细菌之间基因的水平传递，从而从环境中获得耐药基因，并已证实了整合子是耐药基因储存和转移的重要结构[2]，因此对整合子的临床监测是十分必要的。

铜绿假单胞菌为临床上分离阳性率较高的非发酵菌属的细菌，且常呈多重耐药的特点，这给临床抗感染治疗带来了很大的困难。因此，本实验随机挑选了临床多重耐药的铜绿假单胞菌进行整合子系统和相关耐药基因blaCTX-M、blaSHV、blaVIM、blaIMP、OPrD2、aadA、aadB的检测，并对扩增结果进行分析，探讨了整合子系统与多重耐药菌株传播的关系。

1材料与方法

1.1标本来源从2012年5月至2012年10月由大连医科大学附属第一医院住院患者各种标本中分离所得251株铜绿假单胞菌，无重复株。

阴性对照菌株：标准铜绿假单胞菌菌株(ATCC27853),由大连市临床检验中心提供。

整合子I、II、III型阳性菌株：由卫生部北京医院提供。

blaCTX-M、blaSHV、blaVIM、blaIMP、OPrD2、aadA、aadB基因阳性菌株：无锡市克隆遗传研究所提供。

1.2标本的处理及保存实验室对标本的采集和处理均按《全国临床检验操作规程》进行。所有实验菌株均于-80℃保存。

1.3试剂和仪器

1.3.1试剂MH琼脂、美洛培南(MEM，10μg)纸片、米诺环素(MH，10μg)纸片均为英国OXOID公司产品。

细菌DNA提取试剂盒(MiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer.2.0)由大连宝生物公司提供。

整合子I、II、III型基因扩增试剂盒为大连宝生物公司合成。引物序列见表1。

表1　整合子I、II、III型基因引物序列

blaCTX-M、blaSHV、blaVIM、blaIMP、OPrD2、aadA、aadB基因扩增试剂盒为无锡市克隆遗传研究所提供。

1.3.2仪器

全自动细菌鉴定及药敏分析系统WalkAway96由美国德灵公司生产。

全自动数码凝胶图像分析仪Tanon-3500由上海天能科技有限公司生产。

基因扩增仪system9700由美国ABI公司生产。

1.4方法

1.4.1耐药菌株的筛选通过全自动细菌鉴定及药敏分析系统WalkAwayScan96，对菌株进行鉴定和进行药敏分析，通过K-B纸片法对美洛培南和米诺环素补充药物敏感性试验，筛选多重耐药菌株，对三类或三类以上抗生素同时耐药判定为多重耐药。

1.4.2耐药株的整合子系统的检测①细菌DNA的提取挑取单个菌落于1.5ml生理盐水中，35℃孵育过夜。离心弃上清，使用由大连宝生物工程有限公司提供的细菌提取试剂盒(MiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer.2.0)进行细菌基因组DNA的小量纯化，按照说明进行操作。②扩增整合子系统和耐药基因扩增条件均如下：PCR反应体系为50μl：PremixTaq25μl,DNA模板 3μl,20μM引物 2μl,灭菌蒸馏水20μl。扩增条件：94℃ 5min，然后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，共30个循环。72℃ 10min。③电泳结果检测及分析结果检测：配置0．8%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm，电泳30min。结果分析：使用全自动数码凝胶图像分析仪Tanon-3500观察电泳结果。

1.4.3统计学方法通过χ2检验对各组间差异性进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1251株铜绿假单胞菌中检出多重耐药菌株148株，占59.0%。

2.2多重耐药的铜绿假单胞菌中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合子检测结果，见表2。

表2　多重耐药的铜绿假单胞菌中整合子检测阳性菌株分布

2．3整合子系统PCR扩增阳性结果见图1。

图1　整合子I PCR扩增阳性结果

2.4部分耐药基因扩增结果见图2、3、4。

图2　耐药基因VIM扩增结果

图3　耐药基因bla SHV扩增结果

2.5多重耐药的铜绿假单胞菌整合子阳性菌株和阴性菌株的耐药率比较

I类整合子阳性多重耐药的铜绿假单胞菌对美洛培南、头孢哌酮/舒巴坦、环丙沙星、亚胺培南、妥布霉素、左氧氟沙星、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率明显高于阴性组，两者比较差异有显著性意义(P<0.05)，见表3。

图4　耐药基因aadA扩增结果

表3　铜绿假单胞菌整合子阳性菌株和阴性菌株的耐药率分析

2.6多重耐药的铜绿假单胞菌整合子阳性菌株和阴性菌株的耐药基因比较

I类整合子阳性多重耐药的铜绿假单胞菌blaVIM、blaSHV、blaIMP、aadA、aadB检出率明显高于阴性组，两者比较差异有显著性意义(P<0.05)，见表4。

表4　铜绿假单胞菌整合子阳性菌株和阴性菌株的耐药基因分布

3讨论

当今细菌耐药性问题已经成为世界范围关注的问题，通过研究普遍认为当前细菌广泛产生耐药性的原因主要是通过菌株之间的耐药基因的传播引起的，而整合子系统的研究进一步证实了它是细菌耐药基因储存和转移的重要结构。根据整合子基因序列的不同，可以将整合子可以分为6类，目前对前3类整合子的研究最为普遍，其中最常见的是第I类整合子[3]。

近年来，国外大量文献针对整合子和转座子可介导细菌各种耐药基因方面均有报道。多重耐药的发生是由于整合子通常通过首尾相接的方式整合一个或多个耐药基因盒[4]，形成多重耐药性，对人们的健康造成严重的威胁。整合子是细菌基因捕获和表达的一种可移动的遗传单位，它定位于细菌染色体和具有广泛宿主的质粒或转座子上，可携带位点特异性重组系统[5，6]，能整合不同的耐药基因盒，医院环境下的临床菌株在更大的抗生素选择性的压力下，耐药基因盒就更容易被整合。细菌可以利用整合子随机灵活地摄取和切除耐药基因，以对抗抗生素的压力而生存，是细菌有效、方便且不危险的存活机制。

铜绿假单胞菌是引起院内感染的最常见的病原菌，近年来铜绿假单胞菌的耐药性也在不断的上升[7]，且呈现多重耐药的趋势。本研究的251株铜绿假单胞菌中多重耐药株为148株，占59%，说明多重耐药的铜绿假单胞菌已成为大连医科大学附属第一医院临床常见分离菌。

通过对148株多重耐药的铜绿假单胞菌整合子分布情况检测可知：在多重耐药的铜绿假单胞菌中有83株含有I类整合子，占56.1%，而未检出II、III类整合子，这与国内报道结果基本一致[8，9]。

本研究结果发现：在整合子阳性的多重耐药的铜绿假单胞菌中，耐药基因blaVIM、blaSHV、blaIMP、aadA、aadB检出率分别为39.8%、28.9%、25.3%、31.3%和27.7%，和整合子阴性的多重耐药的铜绿假单胞菌比较两者差异性显著(P<0.05)。其中blaSHV基因是编码β-内酰胺酶和的基因，引起铜绿假单胞菌对青霉素类、头孢菌素类等β-内酰胺酶类药物耐药；blaVIM和blaIMP基因是编码碳青霉烯酶的基因，是引起铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药的原因；aadA是编码氨基糖腺苷转移酶的基因，aadB是编码氨基糖苷类乙酰基转移酶的基因，引起铜绿假单胞菌对庆大霉素、妥布霉素的耐药。这与我们通过药物敏感性试验统计结果中发现的：I类整合子阳性多重耐药的铜绿假单胞菌对美洛培南、亚胺培南、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率明显高于阴性组的结论相吻合，说明blaVIM、blaSHV、blaIMP、aadA、aadB等耐药基因盒易被整合子系统所捕获，整合于I类整合子上，存在于整合子阳性的铜绿假单胞中。另外，在整合子阴性的菌株中也存在一定比例的上述耐药基因，说明这些耐药基因还可以以其它方式存在于铜绿假单胞菌中。

此外，blaCTX-M基因是编码对头孢噻肟和头孢曲松具有较高水解能力的β-内酰胺酶的基因；OprD2是导致外膜通道蛋白缺失的基因，也是引起铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药的原因[10]。这两者在整合子阳性和阴性的多重耐药的铜绿假单胞菌中的分布没有显著差异(P>0.05)，说明这了两种耐药基因可能不存在于我院检出的铜绿假单胞菌的整合子基因盒上，而是以其它方式存在与铜绿假单胞菌中，也是引起我院铜绿假单胞菌对头孢菌素高耐药率的一个重要原因。

总之，通过对临床上多重耐药的铜绿假单胞菌的整合子筛查，以及对其耐药基因携带的检测结果表明，整合子系统在非发酵菌属的铜绿假单胞菌中检出率很高，它的存在是铜绿假单胞菌产生多重耐药的一个重要因素。病房应加强细菌的耐药监测及合理选择抗菌药物，控制细菌耐药性的产生和在院内的传播。

参考文献：

[1]YangWJ，YangDD，NaS．Dicerisrequiredforembryonicangiogenesisduringmousedevelopment[J].JBio1,2005，280：9330.

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[4]唐吉斌，宋有良．整合子与鲍曼不动杆菌多重耐药机制研究进展[J].医学综述，2009，15(7)：984．

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[6]蔡敏泓，黄永茂．整合子与大肠埃希菌耐药基因水平转移关系的研究进展[J]．西南军医，2011，12(1)：124．

[7]WangCY，JerngKY，ChenIzN，etal．PandrugresistantPseudomonasaeruginosaamonghospitalizedpatients：clinicalfeatures，risk-factorsandoutcomes[J].ClinMicrobiolInfect，2006，12：63．

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[9]武渊，李慧，梅亚宁，等．在铜绿假单胞菌临床分离株1类整合子中发现携带新型耐药基因盒[J].南京医科大学学报，2008，28 (1)：3741．

[10]YatsuyanagiJ，SaitoS，HarataS，eta1．Class1integroncontainingmetaUoBlactamasegeneblaVIM2inPseudomonasaeruginosaclinicalstrainsisolatedinJapan[J]．AntimicrobAgentsChemother， 2004，48(2)：626．

基金项目：辽宁省教育厅高等学校科研项目(L2010104)

*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)06-0966-04

中图分类号：R378

文献标识码：A

作者简介：肖晓光(1971-)女，主任技师，研究方向：微生物及基因诊断学。

(收稿日期：2013-10-15)

InvestigationonrelationshipbetweenintegronsinP.Aeruginosaandmulti-drugresistant

XIAO Xiao-guang,LI Yan-lian,SUN Guo-hua.

(Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital,Dalian Medical University,Dalian 116011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the carrying situation of integron multi-drug resistant PA and to analyze its association with multiple drug resistance.Methods148 multi-drug resistant PA strains isolated from specimens of hospitalized patients in First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,during May,2012 to October,2012,extracted entire genome,analyzed the PCR product of class Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ integrons and related resistant genes:bla CTX-M、bla SHV,bla VIM,bla IMP,OPrD2,aadA and aadB.ResultsIn multi-drug resistant PA,positive rate of class I integron is 56.1% ( 83 / 148 );no detectable class II and class III integron were found;positive rates of blaVIM,blaSHV,blaIMP，aadA，aadB are 39.8%，28.9%，25.3%，31.3% and 27.7%,which has significant differences with integron negative PA(P<0.05).ConclusionIntegron exists prevalently in PA,its existence is an important factor for PA to perform multiple drug resistance

Key words:multi-drug resistant;integron;drug resistant gene