HPLC法测定桉芩止咳糖浆中黄芩苷及其不确定度评定

刘立民，侯雄军，汤韶明，甘晓云，刘　玲，张五萍

(江西省人民医院，江西 南昌 330006)



HPLC法测定桉芩止咳糖浆中黄芩苷及其不确定度评定

刘立民，侯雄军，汤韶明，甘晓云，刘玲，张五萍

(江西省人民医院，江西 南昌 330006)

[摘要]目的建立桉芩止咳糖浆中黄芩苷的HPLC测定方法，并对所建立方法进行不确定度评定。方法采用HPLC法测定桉芩止咳糖浆中黄芩苷的含量，再根据方法学验证数据，对测定过程中引入的不确定度进行评定，并计算合成不确定度，最终计算出测量结果在95%置信区间下的扩展不确定度。结果采用本方法测定桉芩止咳糖浆中黄芩苷含量的扩展不确定度为2.16%。结论综合不确定度评定，可使测定结果更为准确可靠，可用于桉芩止咳糖浆的质量控制。

[关键词]桉芩止咳糖浆；黄芩苷；不确定度；高效液相色谱法

桉芩止咳糖浆为我院治疗因外感风热、热郁肺经、肺失宣肃所致的咳嗽、咳痰、痰黄或白、喘息等疾病的医院制剂，由桉叶、黄芩、枇杷叶、麻黄、百部、桔梗六味中药组成。方中黄芩具有清热燥湿、泻火解毒之功效，主要含黄芩苷、黄芩素等黄酮类化合物，是桉芩止咳糖浆发挥药效的重要物质基础[1-3]。

测量不确定度是表征合理地赋予被测量值的分散性，与测量结果相关联的参数。由于结果测量定量表征是通过测量不确定度进行的，中国合格评定认可委员会(CNAL)对实验室认可时候均需开展对测量不确定度的评定[4]。本实验对所建立的含量测定方法进行方法学验证的同时，根据中国实验室国家认可委员会颁布的《分析测量中不确定度的评定》[5]，并参考文献[6-8]定量测定不确定度评定方法，对桉芩止咳糖浆中黄芩苷的测定结果进行不确定度评定研究，建立了一套合理、完善的桉叶止咳糖浆的质量评价方法。

1仪器与试药

岛津LC-2010A高效液相色谱仪； Diamonsil C18色谱柱(250x4.6mm，5 μm)；KQ118超声波清洗器；ACS型电子计价天平；AE240万分之一电子分析天平；Sartorius BP211D十万分之一电子分析天平。

黄芩苷(批号：110715-200514，供含测用，中国药品生物制品检定所)；实验所用药材购自江西江中武宁中药有限公司。乙腈(色谱纯，西陇化工股份有限公司)、甲醇(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂)、二级纯化水(本院制剂室提供)，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1黄芩苷的含量测定

2.1.1对照品溶液的制备称取干燥恒重过的黄芩苷对照品0.004 12 g，转移至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得0.4120 mg/mL的黄芩苷对照品溶液，然后将其稀释成浓度为0.309 0，0.206 0，0.103 0，0.051 5，0.025 8，0.012 9，0.006 4 mg/mL的黄芩苷对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备精密量取桉芩止咳糖浆10 mL，用纯化水稀释至200 mL，超声，混匀。取稀释液1 mL，转移至10 mL的容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，超声，混匀，取稀释液适量，用0.45 μm微孔滤头过滤，即得。

2.1.3阴性对照溶液的制备取处方中缺黄芩药材的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备，即得缺黄芩阴性对照供试品溶液。

2.1.4色谱条件色谱柱：Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水=23∶77；检测波长：277 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量10 μL。

2.1.5系统适用性试验取黄芩苷对照品溶液，供试品溶液，阴性对照溶液，注入HPLC色谱仪，按“2.1.4”项下色谱条件检测，结果供试品溶液中黄芩苷得到很好的分离，峰型对称性较好，且阴性无干扰，理论塔板数以黄芩苷计大于2 500，表明此条件适用于供试品中黄芩苷的检测，见图1。

A：黄芩苷对照品溶液(0.103 0 mg/mL)；B：供试品溶液；C：缺黄芩阴性对照图1　黄芩苷HPLC图

2.1.6线性关系考察精密吸取稀释好的黄芩苷对照品溶液，按“2.1.4”项下色谱条件测定。以黄芩苷浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。得回归方程：y=31 335 371.8x+36 068.5(R2=1.000 0，n=8)，表明黄芩苷浓度在0.006 4～0.412 0 mg/mL之间具有很好的线性关系。

2.1.7方法学考察

2.1.7.1精密度试验精密吸取黄芩苷对照品溶液，按“2.1.4”项下色谱条件测定，重复进样6次，测得黄芩苷平均峰面积为3 299 547，RSD为0.26%，表明仪器精密度较高。

2.1.7.2稳定性试验按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于0,1,2,4,8,12 h各进样一次，按“2.1.4”项下色谱条件测定，测得黄芩苷平均峰面积为3 820 700，RSD为0.76%，表明供试品溶液在12 h内稳定性较好。

2.1.7.3重复性试验按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1.4”项下色谱条件测定，测得黄芩苷平均峰面积为3 804 035，RSD为1.53%，表明该法重现性较好。

2.1.7.4加样回收率试验 精密移取同一批桉芩止咳糖浆(黄芩苷含量为24.371 2 mg/mL)，6份，每份10 mL，用纯化水稀释至200 mL，超声，混匀。取稀释液1 mL，转移至10 mL的容量瓶中，精密加入浓度为1.214 0 mg/mL黄芩苷对照品溶液1.0 mL，用70%乙醇稀释至刻度，超声，混匀，取稀释液适量，用0.45 μm微孔滤头过滤，按“2.1.4”项下色谱条件测定，计算回收率，结果平均回收率为98.41，RSD为1.81%，表明该法回收率较高。见表1。

表1　黄芩苷加样回收率试验结果(n=6)

2.2不确定度评价

2.2.1不确定来源分析本实验中不确定度的主要来源为测量过程中的对照品和样品的体积引入不确定度、质量不确定度、样品回收率所导致的不确定度以及液相测试过程中随机效应所带来的不确定度。因此，可采用重复性研究数据以及实验准确度的回收率实验数据，将涵盖所有样品制备与检测过程中的随机效应以及仪器操作、样品基质等因素的系统误差所引起的不确定度进行评定。

2.2.2不确定度分量量化

表2　标准溶液配制的相对不确定度

表3　准确度的不确定度评定

2.2.2.4扩展不确定度及报告不确定度95%置信概率下取包含因子κ=2，则相对扩展不确定度U95(W)=κ×Ucrel(W)=2×0.010 8=2.16%。实验所测批号140915桉芩止咳糖浆的黄芩苷含量W=24.13 mg/mL，故其扩展不确定度为：U95=24.13×0.021 6=0.521 3 mg/mL，其他批次的扩展不确定度见表4。

3讨论

本实验以桉芩止咳糖浆为研究对象，建立其有效成分黄芩苷的定量测定方法，根据《中国药典》规定，方法学验证的内容有准确度、精密度等，但这些试验并未对实验具体测定结果的可信度进行量化。本实验根据不确定度理论对方法的重复性及回收率试验进行不确定度评定，并在 95%的置信区间下，得出本方法所测质量分数结果的扩展不确定度为(W×2.16%)mg/mL，定量描述实验方法的可信度，可作为桉芩止咳糖浆中黄芩苷定量测定方法学验证的一种补充。

表4　桉芩止咳糖浆中黄芩苷含量测定结果(n=3,mg/mL)

在药物分析检测评定不确定度时，应尽可能地分析产生不确定度的所有可能来源。目前，分析测试领域中多采用对每个测定步骤进行分析，从而得出对测定结果的不确定度。但是由于化学分析操作相对较为复杂，需附加实验后再进行B类不确定度的评定，而且其测定过程中对A类不确定度也较难评定，本文通过实验室内部方法学验证法(Validation-based法)的数据进行评定，通过采用方法学考察的准确度与精密度实验，从而进行整体考察检测方法的不确定度，此法适合于中药分析中的实际应用。

[参考文献]

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[S]. 北京：中医药科技出版社,2010:282-283

[2]李彤彤,李宏,侯茂君,等. 黄芩化学成分及黄芩苷提取方法研究进展[J]. 天津药学,2002,14(3):7

[3]延卫东,王瑞君,何琰,等. 黄芩苷药理作用研究进展[J]. 陕西中医,2002,23(12):1127-1129

[4]ISO/IEC 17025:2005,General requirements for the competence of calibration and testing laboratories[S]. Geneve,2005:9

[5]中国实验室国家认可委员会. 化学分析中不确定度的评估指南[M]. 北京: 中国计量出版社,2002

[6]魏惠珍,谢菲,饶毅,等. HPLC 法测定元胡止痛胶囊中延胡索乙素及其不确定度评定[J]. 中草药，2012,43(2):299-302

[7]饶毅,夏川川,周海滨,等. 高效液相色谱法测定白芍总苷的不确定度分析[J]. 中国实验方剂学杂志，2011,17(19):89-93

[8]Dabalus IM,Schweikert TM,Cannavan A. Comparison of methods for the estimation of measurement uncertainty for an analytical method for sulphonamides[J]. Food Addit Contam,2008,25(12):1439-1450

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.19.036

[中图分类号]R965.2

[文献标识码]B

[文章编号]1008-8849(2016)19-2152-03

[通信作者]侯雄军，E-mail：66928053@qq.com

[基金项目]江西省卫生厅中医药科研基金项目(2013A047)

[收稿日期]2016-02-15